局域表面等離子體共振酶聯(lián)免疫法的顯色方法及檢測應(yīng)用

申 珣， 翁國軍*,2， 李劍君， 朱 鍵， 趙軍武*

(1.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點實驗室，陜西西安 710049；2.重慶大學(xué)生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室，重慶 400044)

近年來，隨著納米技術(shù)的興起和發(fā)展，金屬納米顆粒由于其獨特的性能和優(yōu)點(高穩(wěn)定性、易于合成、易于表面修飾等)在傳感平臺的應(yīng)用顯著增加[1,2]。金屬納米顆粒的局域表面等離子體共振使其擁有尖銳的光譜吸收、散射峰、增強電磁場，以及可見光范圍內(nèi)的可調(diào)光譜和高吸光系數(shù)，逐漸成為一種新的優(yōu)良顯色底物[3]。隨著金屬納米結(jié)構(gòu)制備技術(shù)的提升，可以通過控制其形狀、大小、組成、周圍介質(zhì)環(huán)境來響應(yīng)生物識別事件并產(chǎn)生顏色變換，構(gòu)造等離子體生物傳感器用于快速、靈敏、便攜化的檢測[4 - 9]。在此基礎(chǔ)上，本文總結(jié)了將局域表面等離子體共振與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)相結(jié)合的新的比色策略：局域表面等離子體共振ELISA的顯色原理和方法，并介紹其在疾病診斷[10]、食品和環(huán)境檢測[11]等領(lǐng)域的比色檢測進展，最后對當(dāng)前存在的問題和未來的發(fā)展方向進行了分析。

1 局域表面等離子體共振ELISA的原理

1.1 局域表面等離子體共振

局域表面等離子體共振(Localized Surface Plasmon Resonance,LSPR)效應(yīng)是金屬納米粒子所具有的一種獨特的光學(xué)性質(zhì)。金屬中導(dǎo)電的自由電子是由價電子構(gòu)成的，這些價電子不受帶正電的原子核的束縛，會在原子核之間振蕩形成一個平衡的體系，這種正負離子完全分離的體系和原子被電離得到的等離子體很相似，所以被稱為金屬中的等離子體。當(dāng)外界的光或者電磁場對等離子體自由電子產(chǎn)生干擾時，自由電子就會產(chǎn)生一個相對的位移，同時由于反向的庫侖力作用，會在正電荷的周圍做往復(fù)振蕩，這種現(xiàn)象就被叫做等離子體振蕩，當(dāng)這種振蕩頻率與外界入射光頻率相同時，就會產(chǎn)生局域表面等離子共振[12 - 15]。

值得注意的是，由于上述局域表面等離子體共振的作用，大部分入射光的能量被限制在金屬納米顆粒的周圍，從而產(chǎn)生了強大的局部電磁場[16]。增強的局部電磁場提高了金屬納米顆粒的光學(xué)性能，使其表現(xiàn)出高的LSPR的吸光系數(shù)，比常規(guī)的有機染料的吸光系數(shù)高出幾個數(shù)量級[17]。金屬納米顆粒的局域表面等離子體共振一般處于可見光至近紅外光波段，其膠體溶液能夠顯示出醒目的顏色，可用于可視化檢測。金屬納米顆粒的局域表面等離子體共振特性帶來的高吸光系數(shù)，以及醒目的膠體溶液顏色使其成為構(gòu)建高靈敏度、可視化檢測比色傳感器的優(yōu)秀顯色底物。

1.2 局域表面等離子體共振ELISA

1971年，瑞典學(xué)者Engvail、Perlmann和荷蘭學(xué)者Van Weerman、Schuursfen分別報道了將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測液體中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)。在傳統(tǒng)的ELISA中，信號是由酶催化底物產(chǎn)生的有色或者發(fā)光物質(zhì)組成的，這種比色或化學(xué)發(fā)光信號與通過免疫反應(yīng)附著在免疫復(fù)合物上的酶的數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀對目標(biāo)分子進行定量測量[18，19]，具有特異性強、靈敏度高、快速檢測、廉價、操作簡單的優(yōu)點，目前已經(jīng)被廣泛的用于環(huán)境污染[20]、食品[11,21]、醫(yī)學(xué)[22]等領(lǐng)域中。在比色ELISA中，可以通過肉眼直接觀察這種信號來檢測一定濃度的目標(biāo)分子，適合在無法使用復(fù)雜儀器的情況下使用，但是當(dāng)目標(biāo)分析物的濃度較低時，肉眼來分辨淺色溶液的區(qū)別會導(dǎo)致較大的誤差。由于金屬納米顆粒特殊的光學(xué)性質(zhì)，Stevens等首先提出將基于金屬納米顆粒的LSPR現(xiàn)象和傳統(tǒng)的ELISA相結(jié)合，稱為局域表面等離子體共振ELISA法[23，24]，用葡萄糖氧化酶[13，25]、過氧化氫酶[2，4，26]、堿性磷酸酶[12，14，27 - 30]等標(biāo)記的抗體來實現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)化和放大，以金屬納米顆粒作為酶聯(lián)中的顯色底物，改變金屬納米顆粒的距離、形狀、尺寸、種類使得溶液顏色改變。局域表面等離子體共振ELISA與傳統(tǒng)的ELISA不同之處在于，前者不是基于同種顏色色度深淺的區(qū)分，而是基于溶液不同顏色的明顯變化，可通過“裸眼”觀察對目標(biāo)分析物濃度進行定性定量檢測[30]。

在局域表面等離子共振ELISA理論提出的初期，溶液的顏色變化主要是由目標(biāo)分析物的存在導(dǎo)致金屬納米顆粒的聚集而產(chǎn)生的[23,24,31]，這種顏色變化只能定性的檢測溶液中是否存在一定量的待測目標(biāo)物，但不能對于待檢測物質(zhì)進行(半)定量分析，因此在應(yīng)用上還存在一定的缺陷。2016年，Li等[14]提出了利用種子介導(dǎo)的金納米棒(Au NRs)的生長過程來實現(xiàn)多色的ELISA法，利用不同濃度的目標(biāo)分析物引起的多種顏色的變化對待檢測物實現(xiàn)半定量檢測，補充了前者的不足。接著，在2018年Lin等[26]提出的通過對銀包覆的金納米雙錐體的定量蝕刻來引起溶液顏色彩虹般的變化，進一步增加了顏色變化的數(shù)量，提高了檢測的精度，目前有著較大的應(yīng)用前景。

2 局域表面等離子體共振ELISA顯色方法

到目前為止，各種形貌、組成的金屬納米顆粒已經(jīng)被用于構(gòu)建基于局域表面等離子體共振ELISA法的比色傳感器，包括金納米球(Au NBs)、金納米棒(Au NRs)、金納米雙錐體(Au NBPs)[29]、金納米花(Au NFs)[32]、銀納米三角板(Ag TNPs)[20,33]、核/殼Au@Ag納米球[27]、核/殼Au@Ag納米棒[26,34]等，結(jié)合了這些納米顆粒的等離子免疫傳感器已經(jīng)可以用于檢測各種靶標(biāo)。局域表面等離子體ELISA法的顯色方法主要可以分為兩類，如圖1所示，分別是基于分散/聚集的距離變化、基于蝕刻/生長的形貌變化的顯色方法。有研究證明，采用不同的金屬納米顆粒和顯色方法，構(gòu)建的比色傳感器的靈敏度也有所不同[29]。如何根據(jù)目標(biāo)分析物選擇合適的納米金屬材料以及顯色策略，是構(gòu)建基于局域表面等離子體共振ELISA法的比色傳感器的重點。

圖1 局域表面等離子體共振ELISA法的顯色方法Fig.1 Colorimetric methods of localized surface plasmon resonance ELISA

2.1 基于分散/聚集的距離變化的顯色方法

目標(biāo)誘導(dǎo)的金屬納米顆粒的分散/聚集是典型的LSPR顯色方法之一[23,24,35]。當(dāng)金屬納米顆粒間的距離在其粒徑長度的2.5倍時，表面等離子體產(chǎn)生的共振耦合使其LSPR光譜紅移[36]，溶液顏色發(fā)生顯著的變化，通過觀察顏色對目標(biāo)進行定性測量。Stevens等[24]根據(jù)這一原理設(shè)計出一種免疫傳感器，用肉眼檢測血清中的前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)和HIV衣殼抗原p24的存在。在基于聚集/分散的距離變化的顯色方法中，H2O2誘導(dǎo)的金納米顆粒(Au NPs)聚集狀態(tài)的改變將影響納米顆粒的光學(xué)性質(zhì)，而實驗中H2O2的濃度很大程度上決定了納米顆粒聚集的程度，當(dāng)H2O2處于高濃度時，納米顆粒以非聚集的膠體懸浮液的形式生長，溶液呈現(xiàn)出紅色，當(dāng)H2O2處于低濃度時，納米顆粒聚集成簇使得溶液呈現(xiàn)出藍色，因此在檢測中控制H2O2的濃度至關(guān)重要。Yang等[13]通過H2O2抑制苯二硼酸(Benzene-1,4-Diboronic Acid,BDBA)的硼酸和檸檬酸的α-羥基羧酸鹽之間的相互作用，能夠使聚集的Au NPs分散開并伴隨溶液顏色的改變。將H2O2/BDBA/Au NPs探針與免疫分析法相結(jié)合，溶液中目標(biāo)檢測物的濃度和H2O2的濃度成正比，H2O2的濃度決定Au NPs的聚集程度和溶液的顏色，成功的測量了人體免疫球蛋白IgG和人前列腺特異性抗原PSA，肉眼可檢測到的最低濃度分別為0.1 ng/mL和4 ng/mL。

2.2 基于刻蝕/生長的形貌變化的顯色方法

上述基于金屬納米顆粒的分散/聚集的常規(guī)LSPR顯色方法具有設(shè)計簡單、靈敏度高的優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)分子的超靈敏檢測。但是在反應(yīng)的過程中，除了由于目標(biāo)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Au NPs的聚集外，外部環(huán)境造成的溫度、pH、鹽和帶電分子的改變同樣會引起Au NPs的聚集，這種無響應(yīng)的自聚集將會導(dǎo)致假陽性/陰性結(jié)果[4,37]。其次，由于產(chǎn)生顏色變化的種類單一，這種方法只能用于目標(biāo)分子的定性檢測，存在一定的局限性。近年來，多色變化的等離子體傳感器的出現(xiàn)解決了這一問題，通過目標(biāo)分析物誘導(dǎo)的金屬納米顆粒形貌的蝕刻/生長來引起其LSPR峰的移動，由于移動的LSPR峰占據(jù)了大部分的可見光譜，溶液顏色產(chǎn)生多色變化[12 - 15,17]，更適用于裸眼定量檢測分析物的濃度。

2.2.1 單組分金屬納米顆粒的刻蝕與生長金屬納米顆粒的形貌變化可以通過溶液中的氧化/還原的過程產(chǎn)生，目標(biāo)分子誘導(dǎo)溶液中的氧化/還原反應(yīng)，反應(yīng)中氧化劑/還原劑的量與目標(biāo)分子的濃度存在對應(yīng)關(guān)系，當(dāng)溶液中的Au3+/Ag+被氧化劑/還原劑逐漸蝕刻/生長在納米顆粒的表面時，會造成納米顆粒尺寸/形狀的改變并伴隨LSPR共振峰的移動。

氧化劑能夠蝕刻金屬納米顆粒并造成形狀、尺寸的改變[28,33,38 - 41]。例如氧化劑蝕刻的Au NRs的縱橫比改變，能夠引起縱向LSPR峰的顯著藍移和肉眼可見的多色變化。2016年，Ma等[38]設(shè)計了一種基于Au NRs 蝕刻的免疫傳感器，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和核酸進行裸眼半定量檢測。在他們的研究中首次提出了將Au NRs 作為顯色底物，通過選擇性縮短Au NRs的長度產(chǎn)生一系列的顏色變化，這些變化幾乎覆蓋了從400 nm 到760 nm的整個可見光范圍，使得通過肉眼能夠輕松辨別。接著，在另一項研究中，Ma等[2]用同樣的方法裸眼半定量檢測癌胚抗原CEA和PSA，在溶液中添加具有Au NRs的酸性溶液，Au NRs被TMB2+氧化生成Au+。在CTAB存在的情況下，該過程選擇性的發(fā)生在棒的末端，使得棒的長度縮短而直徑幾乎保持不變。除了Au NRs，具有高縱橫比和鋒利邊緣的Ag TNPs由于更強的等離子體共振，常被用于構(gòu)建超高敏感度的免疫傳感器。Yuan等[39]就利用H2O2氧化蝕刻Ag TNPs產(chǎn)生的顏色變化作為信號，通過構(gòu)建間接競爭性pELISA的方法定性定量檢測氟喹諾酮類抗生素，檢測限為0.24 ng/mL，顯示出高靈敏度和良好準(zhǔn)確性。Liang等[33]用類似的方法檢測癌癥標(biāo)志物的濃度，其中Ag TNPs被H2O2氧化成小尺寸的球形納米顆粒，產(chǎn)生藍紫色顏色的改變。

通過控制反應(yīng)過程中還原劑的濃度，可以輕松生長或合成不同尺寸和形狀的納米顆粒。Liu等[25]設(shè)計了一種5 nm直徑的Au NPs生長的方法，利用葡萄糖氧化酶催化生成的H2O2改變Au NPs直徑。在此基礎(chǔ)上，Zhao等[42]利用金納米團簇(Au NCs)的催化特性，將Au NCs和Au NPs兩者同時用于構(gòu)建等離子體免疫傳感器，通過Au NCs的催化作用控制溶液中H2O2的濃度從而影響Au NPs的生長過程。以上兩種方法都利用Au NPs尺寸改變引起的顏色變化作為顯色信號，而Au NBPs比Au NPs具有更尖銳的邊緣，更高的局域場增強和靈敏度，是一種良好的顯色底物。例如Wang等[40]通過抗壞血酸(AA)介導(dǎo)Au NBPs生長顯色的方法證明了這一策略。在他們的實驗中，以抗體作為識別人表皮生長因子受體-2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2 ECD)的探針，水解產(chǎn)生的AA還原溶液中的Au+調(diào)節(jié)金錐體的生長，Au NBPs 的不同生長階段與不同濃度的AA對應(yīng)，視覺檢測限在0.5 ng/mL，該檢測限遠低于血清中HER2 ECD的截止值，可用于乳腺癌的早期診斷。

2.2.2 核/殼結(jié)構(gòu)金屬納米顆粒的刻蝕與生長納米金屬顆粒的LSPR的共振峰的位置對于特定材料具有高度的特異性，例如直徑13 nm的金納米球的LSPR在520 nm處有吸收峰，然而尺寸相同的Ag NPs的LSPR吸收峰在470 nm處[43,44]。將Au NPs作為生長襯底來生長其他具有良好的讀出性能的材料，產(chǎn)生核/殼型納米結(jié)構(gòu)，可進一步提高檢測范圍和靈敏度[1,4,5,26,27,29]。目前，常見的生長襯底有Au NBs[27]、Au NRs[34,35]、Au NFs[32]、Au NBPs[26,29]等。

近年來的研究表明，具有尖銳邊緣的材料例如Au NBPs，通常具有更好的靈敏度，在其表面包覆銀層得到的Au NBP@Ag納米棒，具有類似于Au NRs的特性，通過控制Ag NRs的長度可以輕易地在可見光到近紅外區(qū)域的寬光譜范圍內(nèi)調(diào)整其等離子體波長，為新型基于貴金屬納米顆粒設(shè)計的比色傳感器的構(gòu)建提供了新思路[16,46]。例如Lin等[26]利用羥基自由基介導(dǎo)Au NBPs@Ag NRs的定量蝕刻的方法成功檢測了鱗狀上皮細胞癌抗原。在反應(yīng)的過程中，與蝕刻Au NRs的單向移動相比，Au NBPs@Ag NRs表現(xiàn)出多向的LSPR峰的移動，縱向LSPR峰先藍移，再紅移，最后再藍移，顏色變化的種類較之Au NRs的蝕刻的單向移動更多，靈敏度更高。Xu等[29]利用4-氨基苯酚還原銀沉積在Au NBPs表面的過程設(shè)計了一種超靈敏比色法檢測H5N1病毒，在生長過程中Au NBPs表面銀殼厚度的變化改變了金的折射率，引起LSPR峰的藍移和顏色改變。接著，在Au NBPs@Ag NRs構(gòu)建的比色傳感器的基礎(chǔ)上，Wei等[47]設(shè)計了一種雙模式免疫傳感器，以介孔SiO2納米球作為載體固定二抗和DNA引物，通過雜交鏈反應(yīng)捕獲堿性磷酸酶，其催化產(chǎn)生的抗壞血酸具有雙重功能，一方面可以充當(dāng)電子供體來捕獲CdS/ZnO空心納米棒陣列中的空穴，導(dǎo)致光電流的增加。另一方面，抗壞血酸的還原性使銀在Au NBPs表面沉積，銀殼的形成和增厚導(dǎo)致了生動的色彩變化和光譜的藍移，不同的機制和相對獨立的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使該方法構(gòu)建的傳感器具有更加準(zhǔn)確可靠的性能。

3 局域表面等離子體共振ELISA檢測應(yīng)用

3.1 在疾病診斷中的應(yīng)用

3.1.2 在病原體檢測中的應(yīng)用(1)病毒顆粒的檢測：對于病毒顆粒的檢測，Zhou等[27]提出了一種ALP誘導(dǎo)金屬化的比色檢測的方法檢測H9N2禽流感病毒。將酶促反應(yīng)和金屬納米顆粒的獨特光學(xué)性質(zhì)結(jié)合起來，可以極大的增強光信號，能夠檢測到低至17.5 pg/mL的H9N2病毒，為病毒顆粒的檢測提供了高效、簡便的方法。類似的，Zhan等[48]利用ALP介導(dǎo)的Au NPs聚集的比色方法來檢測呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)，ALP催化ATP去磷酸化生成腺苷和磷酸鹽，而腺苷使得溶液中的Au NPs分散，顏色由藍色變?yōu)榧t色。金屬離子的引入使得去磷酸化的反應(yīng)加速，進一步加速了反應(yīng)時間，血清中RSV的檢測限低至0.021 pg/mL。(2)其他病原體的檢測：Marilene等[49]利用局域表面等離子共振ELISA的方法成功檢測了利什曼原蟲，這種檢測方法不需要復(fù)雜的儀器，檢測利什曼原蟲的靈敏度為94.7%，特異性為100%，在受感染地區(qū)可作為檢測利什曼原蟲感染的輔助工具。而Nie等[50]開發(fā)了一種用于梅毒螺旋體檢測的等離子體ELISA的方法，溶液中存在的梅毒螺旋體導(dǎo)致免疫復(fù)合物的形成，乙酰膽堿酯酶催化乙酰硫膽堿水解產(chǎn)生硫膽堿，硫膽堿使得Au NPs團聚，利用LSPR吸收光譜的移動和溶液顏色的顯著改變定量測量梅毒螺旋體，檢測限為0.98 pg/mL，是傳統(tǒng)的ELISA法靈敏度的1 000倍。

3.2 在食品和環(huán)境的檢測應(yīng)用

3.2.1 有毒有機物的檢測有毒有機物的實時、快速監(jiān)測對于食品安全和環(huán)境保護都有著重要的意義。利用酶催化生成的H2O2影響金屬納米顆粒的生長過程、存在狀態(tài)是局域表面等離子共振ELISA的常見方法之一。例如Peng等[51]設(shè)計出了一種基于H2O2介導(dǎo)Au NPs生長的比色傳感器，成功檢測了甲基睪酮(Methyltestosterone,MT)的濃度。MT是一種在牛的生產(chǎn)周期被非法使用的生長促進劑，隨著食物鏈進入人體后能潛在威脅人體健康，破壞生態(tài)環(huán)境。通過這種方法可以快速、靈敏的檢測低至0.03 ng/mL的MT，具有重要的實用價值。Zhan等[52]利用H2O2還原Au3+在金種子表面生長的原理，設(shè)計了一種免疫傳感器檢測玉米中的伏馬菌素B1(Fumonisin B1,FB1)的濃度，F(xiàn)B1濃度的增加引起Au NPs的生長，溶液產(chǎn)生無色到紫色的顏色變化，肉眼觀察的檢測限為1.25 ng/mL，具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度。類似的，Liang等[35]利用H2O2、辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和酪胺誘導(dǎo)的Au NPs聚集/分散的方法檢測農(nóng)產(chǎn)品中的赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)的含量，以Au NPs聚集/分散的狀態(tài)改變引起的顏色變化作為檢測過程中的輸出信號。在HRP催化H2O2的誘導(dǎo)下，酪胺的酚聚合可以引發(fā)Au NPs的聚集，而被OTA標(biāo)記過的過氧化氫酶(Catalase,CAT)則作為消耗H2O2的競爭抗原，這種方法可以用肉眼檢測到150 pg/mL的OTA。而在另一項研究中，Pei等[32]利用脲酶誘導(dǎo)銀金屬化的方法同樣對農(nóng)產(chǎn)品中OTA的含量進行了檢測。OTA標(biāo)記的脲酶作為競爭抗原能夠水解尿素為氨，在氨分子存在的情況下，葡萄糖中甲?；€原Ag+在Au NSs的表面生成銀殼，肉眼檢測OTA的檢測極限在40 pg/mL，具有更高的靈敏度。這種方法對其他常見的霉菌毒素也具有出色的選擇性，在定性和定量測量真菌毒素和其他污染物方面有著較大的應(yīng)用價值。

3.2.2 細菌的檢測對于水和食品中細菌的快速、準(zhǔn)確檢測是目前食品安全和環(huán)境檢測中迫切需要解決的問題。Chen等[53]設(shè)計了一種基于CAT介導(dǎo)的Au NPs生長的方法檢測食品中的單核增生李斯特菌的數(shù)量。該方法采用夾心形式，通過攜帶聚丙烯酸刷的SiO2納米粒子作為“CAT的容器”，極大的增加了酶的負載和對于信號的放大作用，從而能夠在超低濃度下檢測李斯特菌的數(shù)量。使用這種方法檢測磷酸鹽緩沖液中李斯特菌的檢出限在8×101CFU/g，具有良好的特異性和敏感性，能夠超靈敏檢測細菌病原體。Gao等[45]設(shè)計了一種基于脲酶誘導(dǎo)銀金屬化的免疫傳感器測量腸炎沙門氏菌，捕獲的脲酶能夠催化脲水解為二氧化碳和氨，在葡萄糖存在的情況下，生成的氨可以還原Ag+并形成銀殼沉積在Au NRs的表面。隨著銀殼厚度的增加和長寬比的減小，LSPR峰出現(xiàn)明顯的藍移和溶液顏色的多色變化，通過肉眼觀察的檢出限在1.21×101CFU/mL。

3.2.3 有毒陽離子的檢測隨著工業(yè)的快速發(fā)展，越來越多不可降解的重金屬離子通過各種途徑排放在土壤和水體中，使得生態(tài)系統(tǒng)和食物鏈處于高污染的狀態(tài)，對于這些重金屬陽離子的檢測對人體健康和環(huán)境保護有著重要的意義。Yao等[20]提出了通過H2O2對Ag TNPs蝕刻的方法來檢測水中Cr(Ⅲ)含量，利用競爭性ELISA來構(gòu)建一個信號產(chǎn)生的機制，其中Ag TNPs被H2O2蝕刻的程度與溶液中Cr(Ⅲ)含量的濃度密切相關(guān)，隨著蝕刻的程度不同，溶液產(chǎn)生的相應(yīng)的顏色變化，肉眼可檢測樣品中6.25 ng/mL的Cr(Ⅲ)。

4 總結(jié)與展望

本文主要介紹了局域表面等離子體ELISA方法的原理以及構(gòu)建的比色傳感器在可視化“裸眼”檢測中的應(yīng)用。由于這種傳感策略將傳統(tǒng)的ELISA的方法和金屬納米顆粒相結(jié)合，既提高了檢測的靈敏度和檢測范圍，在疾病診斷、食品安全監(jiān)測和環(huán)境質(zhì)量控制等方面都有著較大的應(yīng)用空間。但是這種基于金屬納米顆粒構(gòu)建的比色傳感策略仍然存在一些問題需要解決。首先，這種傳感機制是基于金屬納米顆粒的距離、尺寸、形貌、構(gòu)成的變化來實現(xiàn)的，因此研究制備出具有光學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性的納米材料至關(guān)重要，目前制備金屬納米顆粒的方法不能滿足合成大規(guī)模使用的高度均勻的納米材料，而且大多數(shù)合成方案都需要較長的孵育時間和繁瑣的洗滌步驟，限制了這些傳感器的實際應(yīng)用。其次，貴金屬納米材料膠體的色彩變化靈敏度還需進一步提高，大部分檢測目標(biāo)物在低濃度時引起的色彩變化還不足以通過肉眼直接分辨。因此制備出穩(wěn)定的具有高度均勻性的金屬納米顆粒，以及對其光學(xué)性質(zhì)的理論研究仍然是未來這一領(lǐng)域需要持續(xù)探索的方向。

總之，和傳統(tǒng)的ELISA檢測方法相比，基于局域等離子共振ELISA構(gòu)建的比色傳感器具有更高的靈敏度和更易于“裸眼”觀察的多色變化。這些明顯的優(yōu)勢為其在醫(yī)療、衛(wèi)生、食品、環(huán)境檢測中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。