葫蘆[8]脲作為流動相添加劑的高效液相色譜法測定牛奶中喹諾酮藥物

吳玉田， 周貽兵， 李 磊， 張 權(quán)， 林 野， 劉利亞

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550004)

喹諾酮類藥物是全合成抗菌素，這類抗生素主要通過抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶作用，阻礙DNA復(fù)制，從而使細(xì)菌死亡。因其成本低廉，抗菌譜廣、抗菌作用強，被廣泛用于人以及畜禽感染性疾病的治療和預(yù)防[1]。隨著社會高速發(fā)展，人們在養(yǎng)殖過程中不嚴(yán)格遵守抗生素藥物用量，致使牛奶等動物源性食品中抗生素類藥物殘留日趨嚴(yán)重。因此，建立牛奶中喹諾酮類藥物的高效準(zhǔn)確測定方法，了解喹諾酮殘留水平，對維護(hù)人民健康具有重要意義。

冠醚、環(huán)糊精等大環(huán)化合物的特殊空腔結(jié)構(gòu)使其能通過范德華力、氫鍵、配位作用等與尺寸合適的有機分子，或可質(zhì)子化的基團(tuán)，如胺基、羥基等離子型化合物發(fā)生主客體相互作用形成配合物[2,3]。其中，環(huán)糊精作為流動相添加劑，用于提高液相色譜靈敏度和分離度，得到了廣泛研究[4 - 6]。葫蘆脲是將苷脲單元通過亞甲基橋聯(lián)起來的新型大環(huán)化合物[7,8]，從結(jié)構(gòu)上看葫蘆脲具有疏水性空腔，而左右兩個端口均勻分布著具有極性的羰基氧原子，這種特殊的分子結(jié)構(gòu)使得葫蘆脲能夠與大量客體小分子自組裝，從而形成葫蘆脲主客體化合物[9,10]。葫蘆脲也是一種潛在的優(yōu)良流動相添加劑，山西師范大學(xué)杜黎明課題組已經(jīng)成功將葫蘆[7]脲作為流動相添加劑，用于檢測金雞丸中的黃藤素和黃連素[11]。黃藤素和黃連素被限制在葫蘆[7]脲的空腔中，其輻射轉(zhuǎn)移的可能性降低，熒光強度增加，提高了該方法的靈敏度。葫蘆脲家族中的葫蘆[8]脲(Q[8])具有高聚合度和較大的疏水空腔和極性端口，有望能與喹諾酮分子相互作用形成穩(wěn)定的包結(jié)配合物[12,13]。本研究考察了以葫蘆[8]脲作為流動相添加劑的高效液相色譜(HPLC)法測定喹諾酮藥物，實驗優(yōu)化了色譜條件，并應(yīng)用于實際樣品的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695型高效液相色譜儀，配Waters 2475熒光檢測器(美國，沃特世公司)；Sigma 3-18K離心機(德國，西格瑪公司)。

葫蘆[8]脲(Q[8])為實驗室自制合成。氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、西諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品均購于德國Dr.Ehrensorfer公司；甲酸、甲醇和乙腈為色譜純，均采購于美國Fisher Chemical公司。實驗用水為Millipore A10超純水機(美國密理博公司)制備的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別稱取氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、西諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99.5%)各10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濃度1 mg/mL，于-18 ℃冰箱保存，用時稀釋。

1.3 色譜分析條件

色譜柱為Waters C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相為甲醇-0.05 mmol/L葫蘆[8]脲水溶液(含0.2%甲酸)，梯度洗脫條件見表1。流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。熒光檢測器檢測，激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長470 nm。

表1 甲醇-葫蘆[8]脲水溶液梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相條件的優(yōu)化

喹諾酮是一類含氮雜環(huán)化合物[14]，喹諾酮分子含有可離子化的氨基和羧基結(jié)構(gòu)，因此流動相的酸度對其色譜行為有顯著的影響[15,16]。通過實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相的水相中未添加甲酸時，多種化合物的色譜峰出現(xiàn)分叉，而隨著添加甲酸的量增加峰形變得尖銳、對稱(圖1)。考慮到色譜柱對甲酸的耐受度，擬定甲酸的添加量為0.2%。比較了流動相中有機相分別為乙腈和甲醇的分離與保留效果，發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為有機相洗脫時會產(chǎn)生較多雜峰，而使用甲醇時雜峰較少，分離度較高。研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆[8]脲在甲醇中溶解度高于乙腈，因此乙腈作為流動相時，可能會造成葫蘆[8]脲與喹諾酮的包結(jié)作用不完全，產(chǎn)生雜峰?？紤]到葫蘆[8]脲的分子量較大，添加后會帶來液相系統(tǒng)的壓力升高，因此本方法最終采用甲醇-0.05 mmol/L葫蘆[8]脲水溶液(含0.2%甲酸)進(jìn)行梯度洗脫。

圖1 西諾沙星色譜圖Fig.1 Chromatogram for the cinoxacinA.methanol-water;B.methanol -0.2% formic acid.

2.2 添加葫蘆[8]脲效果的比較

考察葫蘆[8]脲作為流動相添加劑的效果，在同樣的流動相條件下，實驗對比添加與不添加葫蘆[8]脲的分離效果。如圖2所示，當(dāng)流動相中加入了葫蘆[8]脲之后較未添加的峰形更好，柱效高，分離度更好。故本實驗應(yīng)用葫蘆[8]脲作為流動相添加劑。

圖2 喹諾酮混標(biāo)色譜圖Fig.2 Chromatograms for the quinolone.A.methanol-0.05 mmol/L cucurbit[8]uril aqueous solution(with 0.2% formic acid);B.methanol-water(with 0.2% formic acid)1.Ofloxacin;2.Pefloxacin;3.Norfloxacin;4.Ciprofloxacin;5.Sarafloxacin;6.Cinoxacin.

2.3 實際樣品的測定

2.3.1 樣品前處理精確稱取牛奶樣品2.000 g于50 mL離心管中，加H3PO4100 μL，乙腈4 mL，渦旋振蕩提取，高速離心，取出上清液后加入5 mL正己烷，渦旋1 min，靜置，去除下層清液。殘渣中加入4 mL 乙腈，重復(fù)提取一次，上清液經(jīng)同一份正己烷分配，合并兩次提取液，氮吹至近干，初始流動相定容至1 mL，過濾膜后，待測。

2.3.2 工作曲線及檢出限將氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、西諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為400、200、160、120、80.0、40.0、20.0 ng/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.3”色譜條件下進(jìn)樣分析，以喹諾酮質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程的R2均大于0.9985，以3倍信噪比(3S/N)計算得到檢出限為5～10 μg/kg。具體見表2。

表2 喹諾酮的線性方程和檢出限

2.3.3 加標(biāo)回收率及精密度向空白牛奶樣品中添加低、高2個不同添加量水平的喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)品，計算回收率。得到的喹諾酮的加標(biāo)回收率在64.0%～99.1%之間。在中濃度添加水平下重復(fù)測定6次，計算相對偏差(RSD)，RSD在6.3%～9.8%之間(表3)。

表3 喹諾酮的加標(biāo)回收率及RSD(n=6)

2.3.4 方法應(yīng)用采用所建立的方法對市場上的牛奶進(jìn)行測定。采集當(dāng)?shù)爻袖N售伊利、蒙牛、山花、三元、愛氏晨曦、阿爾樂常見品牌的共15批牛奶樣品。15批樣品中6種喹諾酮均未檢出。

3 結(jié)論

采用葫蘆[8]脲作為流動相添加劑，有效地改善了多組分喹諾酮的峰形、提高了各組分的分離度。該方法準(zhǔn)確、特異性強、靈敏度高，可滿足牛奶樣品中喹諾酮類藥物的測定。