基于石墨烯-金納米粒子復合材料的黃芩苷電化學傳感器的構建及應用

史艷梅， 張 茜， 張俊霞， 李秀敏， 苗明三*

(1.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，河南鄭州 450001；2.紐約醫(yī)學院微生物和免疫學系，美國紐約 10595)

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，其藥用價值廣泛，為臨床常用中藥之一。黃芩苷(Baicalin，BA)作為中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎[1]、抗過敏[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]的藥理作用。市場上含黃芩的中藥制劑種類繁多，而BA常被作為標志物用于藥物的質(zhì)量控制，所以建立快速靈敏的BA檢測方法具有重要意義。目前，BA常用的檢測方法有高效液相色譜法[6]、紫外分光光度法[7]、液-質(zhì)聯(lián)用法[8]和電化學方法[9]等。其中，電化學方法因具有儀器操作簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點而備受關注[10]。眾所周知，電化學傳感器的優(yōu)良性能取決于提高傳感材料的電活性面積及電子傳輸能力。因此，構建高電活性的納米傳感復合材料在電化學分析中具有重要意義。

還原氧化石墨烯(rGO)是一種優(yōu)良的二維蜂窩狀納米材料，碳原子sp2的雜化方式使其具有獨特的片層結構從而具有較大的比表面積[10]，廣泛應用于電化學領域。然而rGO在制備過程中會產(chǎn)生一些結構缺陷，影響其導電性能[11]。金納米粒子(Au NPs)具有導電性好和比表面積大的優(yōu)勢，結合在rGO表面后通過協(xié)同作用可進一步增強納米復合材料的比表面積及電子轉移速率，同時可以有效防止rGO片層間的聚集，提高rGO材料的電化學檢測性能[12]。本研究利用原位還原法制備了Au NPs@rGO納米復合材料，并應用于構建BA電化學傳感器。對實驗條件進行了優(yōu)化，并對BA的電化學反應機理進行了分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)或修飾GCE，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極；高效液相色譜儀(Waters 2695);電子分析天平(ME204，Mettler Toledo)； pHS -3C pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；ELGA Centra R200超純水機(UK)。

黃芩苷(BA)(≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津光復科技有限公司)；檸檬酸鈉、KCl、KH2PO4、Na2HPO4(天津科密歐化學試劑有限公司)；Nafion溶液(Nafion D -520分散液，阿法埃莎化學有限公司)；石墨粉(≥325目，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；HAuCl4·3H2O(ACROS公司)。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

雙黃連口服液(河南太龍藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 Au NPs@rGO納米復合材料的制備

采用Hummers法以石墨粉為原料制備氧化石墨烯(GO)[13]。取25 mL 4.0 mg/mL的GO懸浮液，超聲分散，在攪拌下加入200 μL 1%的HAuCl4并加熱至80 ℃，逐滴加入1.2 mL 80%的水合肼溶液，80 ℃下加熱回流2 h，8 000 r/min離心，水洗3次，重新分散在25 mL水中即得到Au NPs@rGO復合物。取5 mL Au NPs@rGO與0.5%Nafion溶液(1∶1)混合，即得修飾電極的納米復合材料AuNPs@rGO。

1.3 修飾電極的制備

分別用0.3、0.05 μm的Al2O3拋光粉將GCE表面打磨至鏡面狀，依次用乙醇和水各超聲清洗1 min，晾干后，吸取5 μL Au NPs@rGO -Nafion分散液滴涂在GCE表面，紅外燈下干燥后，即可得到修飾電極Au NPs@rGO -Nafion/GCE。

1.4 電化學檢測

在含有BA的0.25 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)中，采用三電極工作體系，在攪拌作用下富集3 min，然后在-0.2～0.7 V范圍內(nèi)進行掃描，利用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)進行測量。測量結束后，用水沖洗電極，隨后在空白PBS中掃描更新電極表面。所有測量均在室溫下進行。

2 結果和討論

2.1 Au NPs@rGO復合材料的表征

利用掃描電鏡(SEM)對Au NPs@rGO復合材料形貌進行分析。如圖1所示，電極表面具有眾多褶皺，顯著增大了電極的比表面積，同時看到Au NPs均勻的分布在rGO表面，表明Au NPs@rGO復合材料構建成功。

圖1 Au NPs@rGO復合材料的掃描電子顯微鏡(SEM)照片F(xiàn)ig.1 SEM image of Au NPs@rGO composite material

2.2 Au NPs@rGO -Nafion/GCE的電化學表征

為了評價Au NPs@rGO -Nafion/GCE的電化學性能，以[Fe(CN)6]3-/4-溶液作為探針，進行循環(huán)伏安(CV)掃描。由圖2可知，裸GCE上有一對典型的氧化還原峰，峰電位差為73 mV，接近理論值69 mV，說明電極狀態(tài)良好，適用于制備修飾電極。在rGO -Nafion/GCE上進行測定時，探針響應峰電流及背景電流明顯增加；且在Au NPs@rGO-Nafion/GCE上時，響應峰電流及背景電流進一步顯著提升，推測可能是由于Au NPs@rGO復合材料顯著提高了電極比表面積，進而增加了反應的活性位點致使其電化學信號顯著增強。為了更好地闡釋復合材料Au NPs-@rGO對電活性比表面積的影響，利用CV法對其進行了探究，根據(jù)Randles-Sevcik公式[14]可計算出Au NPs@rGO -Nafion/GCE和GCE的電活性比表面積分別為0.229 cm2和0.117 cm2。

圖2 GCE(a)、rGO -Nafion/GCE(b) 和Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c)在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環(huán)伏安(CV)圖Fig.2 CVs of bare GCE(a),rGO -Nafion/GCE(b) and Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c) in [Fe(CN)6]3-/4-solutionscan rate:125 mV/s.

2.3 BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的電化學行為

圖3(A)分別為GCE、rGO -Nafion/GCE、Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA中，在125 mV/s掃速下的CV曲線。GCE在0.177 V處出現(xiàn)一個弱的氧化峰，說明裸GCE的吸附能力較弱，電化學反應較慢；在rGO -Nafion/GCE上出現(xiàn)一對典型的氧化還原峰，且響應電流明顯增加；而在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上，響應電流進一步增強，說明由于Au NPs@rGO納米復合材料大的比表面積和良好的導電能力，增強了BA的電化學反應性能。為了研究反應動力學，考察了BA在不同掃描速度下的電化學行為。如圖3(B)所示，隨著掃速的增加，響應電流也逐漸增加。在掃描速率在0.025～0.3 V/s的范圍內(nèi)，峰值電流與掃描速度之間呈良好的線性關系(圖3(C))，推斷BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上是吸附控制的過程。同時，由圖3(B)可知響應峰電位隨掃速的變化也隨之變化，其氧化峰電位(Epa)與掃描速率的對數(shù)(lnv)線性關系良好(圖3(D))，根據(jù)Laviron理論[15]，可計算出BA的電子傳遞數(shù)n為2.2≈2，α值是0.69。采用計時電量法(Q-t)評估BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的飽和吸附量。圖3(E)為Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA溶液(a)及PBS空白溶液(b)中的Q-t曲線，對應的Q-t1/2曲線展示在圖3(F)中。如圖3(F)所示，曲線a和b的斜率幾乎相等，進一步證明了該電化學反應是吸附控制的過程。根據(jù)公式:Q=nFAΓ*計算，BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的飽和吸附量(Γ*)為3.8×10-9mol/cm2。

圖3 (A)不同電極在BA溶液中的CV圖；(B)BA在不同掃描速率下的CV圖(a→l：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3 V/s)；(C)電流和掃描速率之間的校正曲線；(D)Epa和lnv之間的校正曲線；(E)Au NPs@rGO -Nafion/GCE在BA溶液(a)和空白溶液(b)中的計時電量曲線(Q-t)；(F)Q和t1/2之間的校正曲線Fig.3 (A) CVs of different electrodes in baicalin solution;(B) CVs of baicalin at different scan rates(a→l:0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.175,0.2,0.225,0.25,0.275,0.3 V/s);(C) Calibration curve between oxidized current and scan rate;(D) Calibration curve between Epa and lnv;(E) Chronocoulometric curve(Q -t) of Au NPs@rGO -Nafion/GCE in baicalin solution(curve a) and blank solution(curve b);(F) Calibration curve between Q and t1/2

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1 底液pH值和濃度的影響在5 μmol/L BA溶液中，對支持電解質(zhì)PBS的pH值(2.0～9.0)和濃度(0.1～0.35 mol/L)進行了優(yōu)化。如圖4(A)所示，pH=7.0時峰電流達到最大值，隨后開始減小，因此選擇7.0作為測定BA的最佳pH值。同時發(fā)現(xiàn)，隨pH增大，響應峰電位向負電位方向移動，說明有質(zhì)子參與該電極反應[16]。由圖4(B)可知Epa與pH之間存在線性關系，回歸方程為：Epa=-0.0537pH+0.5821，R2=0.9922。方程的斜率與理論值0.059 V/pH相近，說明BA在修飾電極上是等質(zhì)子等電子的過程，鑒于計算所得電子轉移數(shù)為2，可知兩個質(zhì)子兩個電子參與了BA的電化學反應。如圖4(B)所示，PBS濃度在0.1～0.25 mol/L范圍內(nèi)，BA氧化峰電流隨PBS濃度的增大而增大，而后繼續(xù)增加其濃度，響應電流反而減小，故PBS的最佳濃度設定為0.25 mol/L。

2.4.2 富集時間的影響在吸附控制的電化學反應中，富集時間是影響檢測靈敏度的又一重要參數(shù)?？疾炝烁患瘯r間對5 μmol/L BA氧化峰電流的影響，結果如圖4(C)所示，隨富集時間增加，響應電流逐漸增大，至180 s時，吸附量趨于飽和，之后變化緩慢，選擇180 s為最佳的富集時間。

圖4 (A)pH對響應電流的影響；(B) PBS濃度對響應電流的影響；(C) 富集時間對響應電流的影響Fig.4 (A)Effect of pH on response current;(B) Effect of PBS concentration on response current;(C) Effect of enrichment time on response current

2.5 標準曲線及檢出限

在最佳實驗條件下，利用差分脈沖伏安法(DPV)研究了不同濃度BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的電化學響應。圖5可以觀察到峰電流隨著BA濃度的增大而增加，在0.05～10 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性回歸方程為：Ipa=-18.953c-6.8269，R2為0.9961，檢出限(S/N=3)為0.01 μmol/L。說明BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上具有較高靈敏度。

圖5 不同濃度BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L)在PBS(pH=7.0中的DPV圖(插圖是BA濃度與電流之間的校正曲線)Fig.5 DPV of different concentration of BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L) in PBS buffer (pH=7.0)(The insert was the calibration plot between current and BA concentration)

2.6 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和干擾實驗

按照上述制備方法，平行制備5根修飾電極，在最佳條件下放入2 μmol/L的BA溶液中依次測定，結果顯示，傳感器相對標準偏差為3.53%，具有良好的重現(xiàn)性。將使用過的修飾電極，在冰箱中放置7 d后再次進行測量，響應電流值為初始電流的92.20%，具有較好的穩(wěn)定性。

在最佳實驗條件下，評估了幾種可能的干擾物對電極檢測能力的影響。當BA濃度為2 μmol/L，在允許相對誤差為5%時，300倍Ca2+、Mg2+、Zn2+，100倍尿酸，50倍的多巴胺、抗壞血酸對BA信號無影響。說明該方法具有良好的選擇性，可以應用于實際檢測中。

2.7 實際樣品的測定

利用所建立的方法，對雙黃連口服液中BA含量進行測定。分析前取適量的雙黃連口服液，用pH為7.0的0.25 mol/L的PBS稀釋50倍，0.22 μm濾膜過濾后進行電化學測定，計算得到稀釋后口服液中BA的含量為2.78 μmol/L。進一步在該待測液中進行BA加標回收實驗，其回收率在99.60%～105.3%之間，RSD低于3.12%。為了驗證該傳感器的準確性，利用HPLC法對雙黃連口服液中BA的濃度進行檢測。色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：0.6%冰HAc(A相)，乙腈(B相)；洗脫條件：0～4 min，15%→18%B；4～10 min，18%→25%B；10～20 min，25%→30%B；流速：1.0 mL/min；檢測波長為300 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。測得實際樣品中BA的含量為2.65 μmol/L，RSD為1.89%。電化學方法與HPLC法所得結果相吻合，證明所制備的Au NPs@rGO -Nafion/GCE對實際樣品的測定具有較高的準確度。

表1 實際樣品中BA的測定結果

3 結論

利用原位還原法制備了Au NPs@rGO納米復合材料，并用于構建高靈敏的BA電化學傳感器。在最優(yōu)條件下，BA在0.05～10 μmol/L范圍內(nèi)線性關系良好，檢出限為0.01 μmol/L。所構建的Au NPs-@rGO -Nafion/GCE傳感器為中藥制劑中BA的快速靈敏檢測提供了新方法。