超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合內(nèi)標(biāo)法快速檢測毛發(fā)中15種毒品及代謝物

胡駿杰， 郝敬梅， 劉 飛， 杜 樂， 朱 軍， 上官國強(qiáng)

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，山東濟(jì)寧 272067;2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東濟(jì)寧 272067;3.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023)

自2016年11月國家禁毒辦對(duì)《吸毒成癮認(rèn)定辦法》修訂以來，毛發(fā)中毒品及代謝物的檢測結(jié)果已被作為吸毒成癮認(rèn)定的新標(biāo)準(zhǔn)[1,2]。個(gè)體在吸食或注射毒品后，相關(guān)成分及代謝物進(jìn)入毛發(fā)并穩(wěn)定儲(chǔ)存在其中[3]。相較于血液、尿液、唾液等常規(guī)生物檢材，毛發(fā)具有檢測窗口期長、易于采集和便于保存等特點(diǎn)[4 - 6]。從某種程度上說，每段發(fā)絲就像一臺(tái)“時(shí)光機(jī)”，記錄著各種藥毒物的代謝情況，可追溯長達(dá)幾個(gè)月甚至幾年的涉毒行為[7]。因此，高效精準(zhǔn)毛發(fā)分析方法的建立，對(duì)掌握毒品代謝規(guī)律、順利開展禁毒工作意義重大。

毒品及代謝物的分析主要包括氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[8,9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[10 - 12]。近年來隨著LC-MS/MS儀器性能的提升，該方法已被作為毛發(fā)中毒品分析的“首選”及“優(yōu)選”[13,14]。但目前毛發(fā)分析技術(shù)仍面臨前處理流程繁瑣、痕量結(jié)果確證困難等挑戰(zhàn)。基于此，本研究采用具有較高效率的高動(dòng)能研磨法處理毛發(fā)檢材，并對(duì)提取流程進(jìn)行了簡化；建立基于QTRAP質(zhì)譜系統(tǒng)的分段多反應(yīng)監(jiān)測(Scheduled MRM,sMRM)、信息依賴性采集(IDA)、增強(qiáng)離子掃描(EPI)模式聯(lián)用的分析方法：結(jié)合EPI譜庫檢索對(duì)毛發(fā)中15種毒品及代謝物進(jìn)行確證；通過加入內(nèi)標(biāo)監(jiān)測儀器及樣品狀態(tài)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)化合物的定量檢測。該方法樣品前處理簡便快捷，分析流程快速高效，檢測結(jié)果準(zhǔn)確靈敏，可為毛發(fā)中毒品的系統(tǒng)性篩查提供強(qiáng)有力的分析手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Biotage Lysera高效樣品破碎儀(瑞典，Biotage公司)；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)：島津LC-30A型超高效液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)串聯(lián)SCIEX QTRAP 5500質(zhì)譜儀(美國，AB SCIEX公司)。

苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亞甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、甲卡西酮、氯胺酮、去甲氯胺酮、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、美沙酮、曲馬多、芬太尼、Δ9-四氫大麻酚、可卡因、苯甲酰愛康寧、雙苯戊二氨酯(SKF-525A，內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL)來自公安部物證鑒定中心，各化合物結(jié)構(gòu)式見表1；NH4Ac(質(zhì)譜級(jí))、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)購自德國Merck公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex Biphenyl色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)；流動(dòng)相A：5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min,5%B；1.0～1.5 min,5%～20%B;1.5～9.0 min,20%～95%B;9.0～11.0 min,95%B;11.0～11.1 min,95%～5%B;11.1～14.0 min,5%B。流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI源；掃描方式：sMRM-IDA-EPI，正離子模式；離子源參數(shù)：離子源電壓(IS)：5 500 V；氣簾氣(CUR)：30 psi；霧化氣(GS1)：50 psi；輔助氣(GS2)：55 psi；離子源溫度：500 ℃。15種毒品及代謝物和內(nèi)標(biāo)化合物的MRM參數(shù)見表1。

表1 15種毒品及代謝物及內(nèi)標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式、MS/MS采集參數(shù)和保留時(shí)間

(續(xù)表1)

1.3 MS/MS譜庫的建立

分別以50 eV、35 eV及20 eV三種碰撞能量在針泵直接進(jìn)樣模式下，對(duì)15種毒品及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行EPI掃描，建立相關(guān)物質(zhì)的MS/MS譜庫用于檢索，為目標(biāo)物確證提供支持。

1.4 樣品前處理

將毛發(fā)樣品置于離心管中，以適量超純水和丙酮各振蕩洗滌1次，取出晾干。準(zhǔn)確稱取25 mg毛發(fā)檢材，置于含撞珠的研磨管中，依次加入500 μL甲醇，5 μL濃度為500 ng/mL的SKF-525A內(nèi)標(biāo)溶液，3 400 r/min轉(zhuǎn)速下研磨破碎2 min。以0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾研磨液后，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、超純水3種提取溶劑對(duì)毛發(fā)中15種毒品及代謝物的提取效果。結(jié)果顯示，乙腈對(duì)生物檢材中的蛋白成分有較強(qiáng)沉淀作用，導(dǎo)致毛發(fā)角蛋白中包覆的毒品及代謝物成分回收率較低；由于部分毒品及代謝物成分在水溶液中的溶解度較低，因而超純水提取效率低于甲醇。因此，甲醇對(duì)于毒品及代謝物成分的提取具有最廣泛的普適性，實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 前處理流程的簡化對(duì)毛發(fā)檢材的研磨方式分為干磨與濕磨，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道濕磨法提取效果優(yōu)于干磨法[15]，因此實(shí)驗(yàn)選擇濕磨法。對(duì)含15種毒品及代謝物成分的毛發(fā)與甲醇混合研磨后，考察了超聲處理對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示，對(duì)研磨管超聲2 h后過濾研磨液，與研磨后直接過濾研磨液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析各物質(zhì)提取效率無明顯差別。因此，對(duì)毛發(fā)檢材與提取溶劑研磨后直接過濾分析，簡化了前處理流程，縮短了樣品分析時(shí)間。

2.2 質(zhì)譜方法的建立

2.2.1 MRM方法的建立配制濃度為50 ng/mL各目標(biāo)物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液，以針泵直接進(jìn)樣，確定各化合物母離子與子離子質(zhì)荷比，優(yōu)化去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等參數(shù)，建立正離子模式下15種毒品及代謝物的MRM分析方法。

2.2.2 掃描模式的選擇研究充分利用QTRAP 5500液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)優(yōu)勢[16]，選取sMRM-IDA-EPI掃描模式，同時(shí)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定性與定量分析。sMRM的檢測窗口時(shí)間設(shè)置為120 s，這有利于在保留時(shí)間附近捕捉并鎖定目標(biāo)物，提高色譜峰響應(yīng)值，同時(shí)作為IDA的預(yù)掃描，它將觸發(fā)EPI掃描，獲取相關(guān)物質(zhì)的高靈敏二級(jí)譜圖，通過EPI譜庫檢索用于檢出物質(zhì)的確證，對(duì)于毛發(fā)檢材中痕量物質(zhì)的分析具有重要意義。

2.3 液相色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇為確保各類化合物在色譜柱上有較好的保留及分離效果，實(shí)驗(yàn)考察了Phenomenex Kinetex Biphenyl柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)與Venusil MP C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)兩種色譜柱的分離效果。結(jié)果顯示，各化合物在Phenomenex Kinetex Biphenyl柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)上的分離效果明顯優(yōu)于Venusil MP C18柱，各目標(biāo)物基本實(shí)現(xiàn)分離，峰形理想。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相中有機(jī)相對(duì)15種毒品及代謝物的分離效果。以甲醇作為流動(dòng)相的有機(jī)相，在梯度洗脫程序下，考察了0.1%甲酸與0.1%甲酸加5 mmol/L NH4Ac對(duì)色譜峰峰形的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相中NH4Ac的存在能明顯改善各物質(zhì)峰形。因此，實(shí)驗(yàn)選用5 mmol/L NH4Ac溶液(含0.1%甲酸水溶液)-甲醇作為流動(dòng)相。方法優(yōu)化后毛發(fā)基質(zhì)中添加15種毒品及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)提取離子流色譜圖如圖1所示，其各自保留時(shí)間見表1。

圖1 毛發(fā)基質(zhì)中添加15種毒品及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)化合物的提取離子流(EIC)色譜圖Fig.1 EIC chromatogram of 15 drugs,their metabolites and internal standard spiked in hair matrix

2.4 EPI譜庫檢索

分別在高、中、低三種碰撞能量下，對(duì)15種毒品及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行EPI掃描，建立相關(guān)物質(zhì)的EPI譜庫。在實(shí)際樣品檢測中，將sMRM-IDA-EPI掃描模式下獲取的EPI二級(jí)譜圖，進(jìn)行譜庫檢索匹配，全面對(duì)比各物質(zhì)的離子碎片特征信息：例如，EPI譜庫中甲基苯丙胺、氯胺酮、嗎啡的MS/MS譜圖(圖2A1～A3)與毛發(fā)基質(zhì)中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的EPI譜圖(圖2B1～B3)具有高度一致性。實(shí)驗(yàn)中，sMRM 檢測方式提供了最高的靈敏度與特異性，MS/MS譜圖檢索為相關(guān)物質(zhì)的確證提供了可靠支持，二者為毒物篩查與定量分析提供了強(qiáng)大的技術(shù)保障。

圖2 甲基苯丙胺、氯胺酮及嗎啡的標(biāo)準(zhǔn)品(A1-A3)與毛發(fā)基質(zhì)中加標(biāo)樣品(B1-B3)的EPI二級(jí)譜圖Fig.2 EPI MS/MS spectra of standard(A1-A3) and hair-spiked(B1-B3) amphetamine,ketamine and morphine

2.5 方法性能指標(biāo)

2.5.1 檢出限、定量限、線性范圍及回歸方程準(zhǔn)確稱取25 mg潔凈的空白毛發(fā)樣品14份，置于研磨管中，并在各管中加入1 mL一系列濃度梯度的15種毒品及化合物混標(biāo)溶液，以N2吹干，制備成含毒品及代謝物0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mg以及5.0 ng/mg的7組毛發(fā)樣品，每個(gè)濃度組設(shè)置兩個(gè)平行樣。將各樣品按“1.4”流程前處理后，進(jìn)行LC-MS/MS分析。以15種化合物定量離子對(duì)峰面積與SKF-525A定量離子對(duì)峰面積比值，對(duì)各物質(zhì)含量作圖并進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸曲線方程及相關(guān)系數(shù)，見表2。在0.05～5.0 ng/mg范圍內(nèi)，15種毒品及代謝物線性方程的相關(guān)系數(shù)R均大于0.995，方法檢出限(S/N≥3)0.5～10 ng/g，定量限(S/N≥10)10～35 ng/g。之前文獻(xiàn)中報(bào)道的毛發(fā)中毒品定量多采取外標(biāo)法[10,16]，本研究采用內(nèi)標(biāo)法，以SKF-525A為內(nèi)標(biāo)，不僅可避免測定儀器、樣品基質(zhì)等因素帶來的誤差，提高準(zhǔn)確度，還可通過內(nèi)標(biāo)物的峰形、峰面積等因素監(jiān)測樣品與儀器運(yùn)行狀態(tài)是否正常。根據(jù)2018年公安部頒布《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測規(guī)范》規(guī)定，各物質(zhì)檢出限低于規(guī)定閾值，滿足實(shí)際需要。

表2 15種毒品及代謝物線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2 回收率與重現(xiàn)性分別在空白毛發(fā)中添加低、中、高濃度混標(biāo)，制成含0.05、0.2、1.0 ng/mg毒品及代謝物的樣品，每個(gè)濃度組設(shè)置6個(gè)平行樣品，按照“1.4”方法流程處理，與標(biāo)準(zhǔn)提取添加樣品做比，計(jì)算回收率，同時(shí)計(jì)算精密度。15種毒品及代謝物回收率在低、中、高三個(gè)添加濃度下回收率為89.2%～117.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～7.1%，結(jié)果見表3。

表3 毛發(fā)中15種毒品及其代謝物的回收試驗(yàn)(n=6)

(續(xù)表3)

2.6 實(shí)際樣品分析

從本實(shí)驗(yàn)室2020年6月接收的毛發(fā)檢材中隨機(jī)抽取10份，編號(hào)為101～110，采用本方法分析，獲取MRM譜圖及EPI譜圖，并進(jìn)行譜庫檢索比對(duì)，確證定性結(jié)果。進(jìn)一步將檢出物離子對(duì)峰面積與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積之比帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算相關(guān)物質(zhì)含量。各樣品檢測結(jié)果見表4。108、109和110號(hào)樣品未檢出15種毒品及代謝物成分；101、102及103號(hào)毛發(fā)樣品檢出甲基苯丙胺，且102號(hào)樣品檢出代謝物苯丙胺，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品及檢出代謝物提取離子色譜圖見圖3A；104、105號(hào)樣品檢出嗎啡；106、107號(hào)樣品檢出氯胺酮，其中107號(hào)樣品氯胺酮含量較高，同時(shí)檢出代謝物去甲氯胺酮，與標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子色譜比對(duì)如圖3B所示。

表4 毛發(fā)樣品檢測結(jié)果

圖3 空白毛發(fā)中添加苯丙胺(A1)、去甲氯胺酮(B1)標(biāo)準(zhǔn)品(添加濃度0.2 ng/mg)與102號(hào)(A2)、107號(hào)(B2)樣品中檢出代謝物的提取離子色譜圖(EIC)比對(duì)Fig.3 Comparisons of EICs of standard amphetamine(A1) and normeketamine(B1) spiked in blank hair(spiked concentrations:0.2 ng/mg),and detected metabolites in No.102(A2) and No.107(B2)

3 結(jié)論

建立了毛發(fā)中15種毒品及代謝物的UPLC-MS/MS分析方法，應(yīng)用sMRM-IDA-EPI掃描模式，結(jié)合譜庫檢索，確證定性結(jié)論；以內(nèi)標(biāo)法定量，準(zhǔn)確靈敏。該方法前處理流程簡便快捷，采用EPI掃描獲取的質(zhì)譜圖與譜庫進(jìn)行匹配，增強(qiáng)了結(jié)果可信度，適用于毛發(fā)樣品的快速分析，為禁毒提供技術(shù)支持。