米貝地爾增強(qiáng)3，3′-二吲哚甲烷對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用

姜袁越，徐偉，顧杰，葉洋，徐新明，孫俊，陳健，陸榮柱,5

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 2. 昆山市中醫(yī)醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215300； 3.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 4. 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215132；5.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)研究中心，江蘇 蘇州 215300)

調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)游離鈣(cytosolic free calcium，[Ca2+]i)可影響腫瘤細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等[1]，鈣通道阻滯劑因其阻斷鈣通道運(yùn)輸[Ca2+]i至周圍細(xì)胞的功能，在腫瘤的實(shí)驗(yàn)治療中有所應(yīng)用[2-4]，可能與降低[Ca2+]i外流，促進(jìn)[Ca2+]i聚集，進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞[5-6]、乳腺癌細(xì)胞[7-8]、黑色素瘤細(xì)胞[9]等腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。因此調(diào)節(jié)鈣離子通道的功能可調(diào)控[Ca2+]i水平，進(jìn)而可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，植物化學(xué)物3，3′-二吲哚甲烷(3，3′-diindolylmethane, DIM)能上調(diào)IFNγ表達(dá)，其主要通過激活與[Ca2+]i相關(guān)的p38 MAPK信號(hào)通路[10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，[Ca2+]i水平增高和p38 MAPK磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活是鈣離子載體A23187增強(qiáng)DIM抗肝癌細(xì)胞效應(yīng)的重要機(jī)制[11]。在前列腺癌細(xì)胞中，DIM通過升高[Ca2+]i誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在宮頸癌細(xì)胞中，DIM通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的耗竭引起細(xì)胞死亡[12]，因而提示DIM擾亂鈣穩(wěn)態(tài)途徑具有腫瘤細(xì)胞特異性。因此，本研究擬通過T型鈣通道阻滯劑米貝地爾調(diào)控[Ca2+]i，進(jìn)而探討鈣通道在DIM對(duì)肝癌細(xì)胞[Ca2+]i的影響中的作用及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞購自中科院細(xì)胞生物學(xué)研究所；高糖培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DIM、米貝地爾、[Ca2+]i熒光探針Fluo-3/AM(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(日本Dojindo公司)；β-肌動(dòng)蛋白、羊抗兔二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、cleaved-caspase 3、p-p38 MAPK單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；ECLIPSE TE2000-U倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基內(nèi)，其中含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。將細(xì)胞于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.3 細(xì)胞分組

將肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞按“1.2”方法培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，各分為4組，對(duì)照組用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24.5 h；米貝地爾組用5 μmol/L米貝地爾處理24.5 h；DIM組用60 μmol/L DIM處理24.5 h；米貝地爾+DIM組用5 μmol/L米貝地爾預(yù)處理0.5 h，再與60 μmol/L DIM共同處理24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 普通倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

取“1.3”各組處理后細(xì)胞，PBS沖洗，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.5 熒光探針檢測(cè)肝癌細(xì)胞[Ca2+]i水平

以5×105個(gè)/孔密度將肝癌SMMC-7721、HepG2細(xì)胞接種至6孔板，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，按“1.3”分組處理后，PBS洗滌3次，每次5 min；每孔加入5 μmol/L Fluo-3/AM工作液300 μL，覆蓋細(xì)胞表面；37 ℃避光孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min；甘油封片，倒置熒光顯微鏡獲得[Ca2+]i成像，激發(fā)波長(zhǎng)480～500 nm。

1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

以5×103個(gè)/孔密度將肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞接種至96孔板。待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，按“1.3”分組處理后，每孔加入CCK-8試劑和高糖培養(yǎng)基的混合物，二者體積比為CCK-8 ∶高糖培養(yǎng)基=1 ∶10，37 ℃避光孵育40 min；測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處光密度(D)值；重復(fù)3次。

1.7 Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

以1×104個(gè)/孔密度將肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞接種至24孔板。待細(xì)胞貼壁融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，按“1.3”分組處理后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次；每孔加入300 μL Hoechst染液，37 ℃避光染色30 min；PBS清洗5 min，甘油封片。在紫外光激發(fā)的倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞成像，凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+非凋亡細(xì)胞數(shù))×100%；重復(fù)3次。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取“1.3”分組細(xì)胞；棄培養(yǎng)基，將新鮮蛋白裂解液(磷酸酶抑制劑 ∶PMSF ∶RIPA裂解液=2 ∶1 ∶100)加入培養(yǎng)皿置于4 ℃裂解15 min，收集全蛋白； 4 ℃以12 000×g離心15 min，取上清液；BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，加入適量的5×上樣緩沖液，調(diào)至相同濃度，經(jīng)振蕩儀振蕩30 s后，100 ℃煮沸5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白于80 V經(jīng)SDS-PAGE分離；300 mA轉(zhuǎn)膜90 min至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；將PVDF膜放入對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液中，其中PCNA、cleaved-caspase 3、p-p38 MAPK稀釋比均為1 ∶1 000，β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，稀釋比為1 ∶10 000，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋液(稀釋比為1∶10 000)，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；在暗室中加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯影。采用Lane 1D軟件處理結(jié)果圖像；重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

與對(duì)照組相比，米貝地爾組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，但DIM組細(xì)胞數(shù)變少，細(xì)胞分散，分布較稀疏，細(xì)胞融合度降低，細(xì)胞形態(tài)變小、變細(xì)，貼壁能力降低。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組細(xì)胞數(shù)量更少，細(xì)胞形態(tài)破壞更嚴(yán)重。由此提示，米貝地爾單獨(dú)處理并不能影響細(xì)胞形態(tài)，卻能夠增強(qiáng)DIM對(duì)細(xì)胞形態(tài)損傷以及降低細(xì)胞貼壁能力。見圖1。

圖1 各組肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(40×)

2.2 米貝地爾預(yù)處理增強(qiáng)DIM致肝癌細(xì)胞增殖活力下降

CCK-8結(jié)果顯示，在肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，米貝地爾組內(nèi)細(xì)胞活力變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但DIM組細(xì)胞活力明顯降低(q=11.27, 12.46,P均<0.05)。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞活力明顯降低(q=4.973, 5.647,P均<0.05)。由此提示，無細(xì)胞毒性的米貝地爾能夠增強(qiáng)DIM導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖活力下降效應(yīng)。見圖2。

圖2 CCK8法檢測(cè)各組肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞增殖活力變化

2.3 肝癌細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

在肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，DIM組PCNA蛋白表達(dá)明顯降低(q=12.8, 18.51,P均<0.05)，但米貝地爾組中PCNA蛋白水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組細(xì)胞PCNA表達(dá)水平明顯降低(q=6.81, 8.35,P均<0.05)。見圖3。由此顯示，米貝地爾本身并不能降低肝癌細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)，但可增強(qiáng)DIM對(duì)肝癌細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)水平的抑制。

與對(duì)照組相比，DIM組細(xì)胞cleaved-caspase 3及p-p38 MAPK表達(dá)水平均明顯升高(P均<0.05),米貝地爾組cleaved-caspase 3及p-p38 MAPK水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組cleaved-caspase 3和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05)。見圖3。由此提示，米貝地爾可增強(qiáng)DIM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞cleaved-caspase 3及p-p38 MAPK表達(dá)水平升高效應(yīng)。

圖3 免疫印跡法檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.4 米貝地爾增強(qiáng)DIM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)

與對(duì)照組相比，DIM組處理后，肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞凋亡水平明顯升高(q=6.803，4.811，P均<0.05)，米貝地爾組細(xì)胞凋亡水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DIM組比較，米貝地爾+DIM組SMMC-7721和HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加(q=11.34, 8.018,P均<0.05)。見圖4。由此提示，米貝地爾雖然對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡水平并無直接作用，但是能夠增強(qiáng)DIM誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。

圖4 Hoechst染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平

2.5 肝癌細(xì)胞[Ca2+]i熒光水平變化

Fluo 3/AM熒光探針與[Ca2+]i結(jié)合后，激發(fā)綠色熒光。如圖5所示，與對(duì)照組相比，DIM組肝癌SMMC-7721、HepG2細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平升高，而米貝地爾組肝癌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平無變化；與DIM組相比，米貝地爾+DIM組[Ca2+]i水平升高。由此提示，DIM能夠升高肝癌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平，米貝地爾預(yù)處理能夠增強(qiáng)DIM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平升高。

圖5 熒光探針法檢測(cè)肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞[Ca2+]i水平(標(biāo)尺100 μm)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，T型鈣通道阻滯劑米貝地爾可增強(qiáng)DIM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制肝癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)，其機(jī)制與激活p-p38 MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及升高肝癌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i水平有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，與DIM組相比，米貝地爾+DIM組細(xì)胞增殖活力降低且凋亡指數(shù)升高，提示聯(lián)合使用鈣通道阻滯劑與植物化學(xué)物DIM，一方面可抑制肝癌細(xì)胞增殖水平，另一方面可提高肝癌細(xì)胞凋亡水平，表明T型鈣通道阻滯劑米貝地爾能夠增強(qiáng)DIM(60 μmol/L)的抗肝癌細(xì)胞效應(yīng)，這與鈣通道阻滯劑氨氯地平增強(qiáng)長(zhǎng)春新堿對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化療效果[13]以及米貝地爾提高編碼RAF家族中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的BRAF基因靶向藥物維羅非尼的抗癌效應(yīng)[14]等研究結(jié)果相一致。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種植物化學(xué)物抗癌機(jī)制涉及p-p38 MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，如姜黃素誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，其主要涉及上調(diào)cleaved-caspase 3、P53蛋白表達(dá)水平及降低總caspase 3蛋白表達(dá)水平[15]。細(xì)胞內(nèi)p-p38 MAPK途徑、線粒體途徑、氧化應(yīng)激途徑是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制[16]。本研究結(jié)果顯示，米貝地爾預(yù)處理+DIM處理后，cleaved-caspase 和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示米貝地爾可激活p38 MAPK蛋白磷酸化信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)DIM抗肝癌效應(yīng)。

研究表明，擾亂[Ca2+]i可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，其可能與破壞細(xì)胞周期、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等相關(guān)[17]。在成纖維L929細(xì)胞中，L型鈣通道抑制劑維拉帕米或硝苯地平可抑制新曲霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，其可能與蛋白激酶C功能抑制及cAMP失活相關(guān)。鈣通道阻滯劑通過降低cAMP活性，抑制細(xì)胞周期，也可通過直接水解caspase-3、caspase-9，誘導(dǎo)p-p38 MAPK活化促進(jìn)凋亡的發(fā)生[18]。本研究結(jié)果表明，DIM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i熒光水平升高，米貝地爾+DIM組[Ca2+]i熒光強(qiáng)度明顯高于DIM組，由此提示，米貝地爾可增強(qiáng)DIM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞[Ca2+]i升高。此外，米貝地爾預(yù)處理肝癌細(xì)胞凋亡指數(shù)與[Ca2+]i均升高，表明凋亡與[Ca2+]i水平升高可能有伴隨效應(yīng)；細(xì)胞cleaved-caspase 3和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平升高可能與米貝地爾增強(qiáng)DIM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞[Ca2+]i水平升高相關(guān)。[Ca2+]i調(diào)控下游鈣調(diào)蛋白促進(jìn)PCNA結(jié)構(gòu)域磷酸化，進(jìn)而抑制DNA聚合酶合成，阻斷細(xì)胞周期[19]。本研究中米貝地爾+DIM組[Ca2+]i升高，而PCNA蛋白表達(dá)降低，提示高[Ca2+]i水平可能參與降低PCNA表達(dá)水平，[Ca2+]i水平升高可能是米貝地爾增強(qiáng)DIM抑制肝癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。

本研究中T型鈣通道阻滯劑米貝地爾對(duì)SMMC-7721及HepG2肝癌細(xì)胞形態(tài)、增殖活力、凋亡水平并無直接作用，其可能與5 μmol/L米貝地爾抑制肝癌細(xì)胞膜上鈣通道功能后，肝癌細(xì)胞[Ca2+]i外流受限，而胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體鈣庫的儲(chǔ)備達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)[20]。

關(guān)于米貝地爾與DIM誘導(dǎo)[Ca2+]i的研究仍不完善，需要增加一些新的指標(biāo)，如胞質(zhì)游離鈣相關(guān)蛋白測(cè)定，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)游離鈣水平檢測(cè)等。研究表明，10 μmol/L米貝地爾處理HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞后能夠激活A(yù)kt絲裂原活化蛋白激酶通路調(diào)控增殖相關(guān)通路[21]進(jìn)而減弱米貝地爾對(duì)腸癌的抑制效應(yīng)，但本研究中無細(xì)胞毒性的5 μmol/L米貝地爾并未誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的變化，這是否與肝癌細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞差異性有關(guān)有待進(jìn)一步研究。