低氧對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞株中TWIST表達(dá)的影響

毛正發(fā)，羅鈞藝，李熙，馬小艷

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江212001； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 3. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001)

胰腺癌是預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤之一[1-2]。微環(huán)境低氧在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[3]。低氧可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epitheliale-mesenchymal transition，EMT)，從而增強(qiáng)遷移和侵襲[4]。不同部位消化道腫瘤，組織微環(huán)境低氧程度不同。胰腺癌組織的病理特征表現(xiàn)為高度成纖維細(xì)胞纖維化反應(yīng)，組織缺乏血供，嚴(yán)重低氧的微環(huán)境。與預(yù)后較好的胃腸道腫瘤相比，胰腺癌更易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這提示胰腺癌高度侵襲性生物學(xué)行為可能與腫瘤微環(huán)境的極度低氧具有緊密的相關(guān)性。但是低氧如何促進(jìn)胰腺癌的惡性生物學(xué)行為，其機(jī)制仍未完全清楚。

TWIST是一種高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于脊椎動(dòng)物的正常發(fā)育至關(guān)重要。已有研究表明，TWIST是一種促癌基因，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中均高表達(dá)[5-8]。胰腺癌中TWIST作為一種促癌基因，在組織中高表達(dá)且促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[9]。低氧環(huán)境可以顯著誘導(dǎo)TWIST蛋白高表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌血管生成、EMT、轉(zhuǎn)移以及順鉑耐藥[10]。但是低氧環(huán)境誘導(dǎo)TWIST表達(dá)升高的具體機(jī)制尚未完全明確。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)修飾是高等真核生物中含量最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾，是一種動(dòng)態(tài)可逆的RNA修飾方式，主要由RNA甲基轉(zhuǎn)移酶、RNA去甲基化轉(zhuǎn)移酶和RNA甲基化修飾結(jié)合蛋白協(xié)同調(diào)控[11-12]。 m6A動(dòng)態(tài)修飾在維持生理平衡中起著關(guān)鍵作用，異常的m6A修飾可能是腫瘤發(fā)生的重要誘因[13]。甲基轉(zhuǎn)移酶樣分子3(METTL3)是經(jīng)典的m6A RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，可以對(duì)mRNA進(jìn)行m6A修飾。m6A修飾被不同的RNA甲基化修飾結(jié)合蛋白識(shí)別可引起不同類(lèi)型的RNA代謝效應(yīng)，包括mRNA的穩(wěn)定性、pre-mRNA的加工剪接[14]、翻譯、出核[15]等。本研究探討了低氧環(huán)境對(duì)TWIST表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人單克隆抗體TWIST、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白、E-鈣黏蛋白、METTL3(美國(guó)Abcam公司)。其他化學(xué)品均為美國(guó)Sigma 公司或Fisher Scientific 公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC， 置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5%CO2空氣濃度，37 ℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血清，2 mmol/mL谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素；低氧培養(yǎng)持續(xù)通入94% N2∶5% CO2∶1% O2的混合氣體。

1.3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)低氧下PANC-1細(xì)胞TWIST蛋白的表達(dá)

將PANC-1細(xì)胞種于培養(yǎng)皿低氧培養(yǎng)0、12、24、48 h后收集細(xì)胞，使用RIPA緩沖液裂解并進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)檢測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小配置相應(yīng)濃度的分離膠及濃縮膠。蛋白質(zhì)變性后行SDS-PAGE，70 V 2 h；350 mA轉(zhuǎn)膜2 h，將凝膠分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜洗滌后5% BSA封閉1h；TWIST一抗1 ∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加HRP偶聯(lián)的二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，然后用ECL試劑盒曝光檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

1.4 免疫熒光檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

將PANC-1細(xì)胞鋪板于蓋玻片上低氧培養(yǎng)48 h后，在室溫下用PBS洗滌細(xì)胞3次，并在冰上用4%多聚甲醛固定30 min。用含有5%山羊血清、2%驢血清、2% BSA、0.1%Tween-20和0.3%Triton X-100的PBS在室溫下封閉細(xì)胞1 h。PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，TWIST(1 ∶300)、α-SMA(1 ∶300)、波形蛋白(1 ∶200)、 E-鈣黏蛋白(1 ∶100)抗體稀釋后，4 ℃下孵育過(guò)夜。PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，二抗(Alex Fluro 594-標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)以1 ∶4 000稀釋度常溫下孵育2 h。PBS清洗細(xì)胞3次，每次10 min。用PBS稀釋的DAPI染液(1 ∶3 000)，室溫避光孵育細(xì)胞15 min。孵育結(jié)束后用PBS清洗細(xì)胞5次，每次5 min。使用倒置共聚焦激光顯微鏡拍照。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)低氧條件下敲低TWIST后PANC-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

1.5.1 質(zhì)粒構(gòu)建 針對(duì)TWIST的小干擾RNA(siRNA)由吉瑪公司設(shè)計(jì)和合成，TWIST序列如下：正向引物5′-GGACAAGCUGAGCAAGAUUCA-3′，反向引物5′-UGAAUCUUGCUCAGCUUGUCC-3′。TWISTScramble-序列：正向引物 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反向引物 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

1.5.2 病毒包裝 使用293T細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，接種于15 cm培養(yǎng)皿。傾去培養(yǎng)液，用1 mL D-Hank′s液洗滌細(xì)胞2次。加入1 mL胰蛋白酶-EDTA液, 混勻后，37 ℃放置2～3 min。小心吸去胰酶溶液，加入2 mL含10% 胎牛血清的DMEM，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種15 cm培養(yǎng)皿，加入18 mL含10% 胎牛血清的DMEM，混勻后37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜。在一支無(wú)菌的5 mL離心管中加入1.5 mL無(wú)血清DMEM，按比例加入穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，混勻，取另一支無(wú)菌的5 mL離心管，加入1.5 mL無(wú)血清DMEM，再加入300 μL RNAi-Mate，混勻，室溫放置5 min后將兩管混合，室溫放置20～25 min。除去15 cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入8 mL無(wú)血清的DMEM。將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入15 cm培養(yǎng)皿中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育4～6 h。吸棄轉(zhuǎn)染液，加入18 mL含10%胎牛血清的DMEM，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.5.3 蛋白質(zhì)印跡 將病毒轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，在24孔板內(nèi)加入8 μg/mL凝聚胺，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育0.5 h后，再選擇2孔分別加入對(duì)照病毒和目的病毒。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TWIST-siRNA 隨機(jī)序列，處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染TWIST-siRNA。低氧及常氧條件下培養(yǎng)，檢測(cè)TWIST敲低后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，抗體按如下濃度稀釋?zhuān)害?SMA(1 ∶1 000)、波形蛋白(1 ∶1 000)、 E-鈣黏蛋白(1 ∶500)，方法同步驟“1.3”。

1.6 檢測(cè)低氧條件下METTL3的表達(dá)

1.6.1 qRT-PCR檢測(cè)PANC-1細(xì)胞株中METTL3的表達(dá) PANC-1細(xì)胞缺氧培養(yǎng)12、24、48 h后，收集細(xì)胞。使用Lighter Cycle-DNA Master SYBR Green Ⅰmixture (瑞士 Roche Applied Science公司)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)置如下：95 ℃ 3 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)。為確保擴(kuò)增的特異性，每對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物都進(jìn)行熔解曲線和電泳分析。METTL3引物序列：正向引物5′-GTCCATCTGTCTTGCCATCTC-3′，反向引物5′-GAGACCTCGCTTTACCTCAATC-3′。

1.6.2 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)METTL3的表達(dá) METTL3抗體1 ∶1 000稀釋?zhuān)瑱z測(cè)方法同步驟“1.3”。

1.7 檢測(cè)低氧條件下PANC-1細(xì)胞總m6A水平

1.7.1 比色法檢測(cè)PANC-1細(xì)胞總m6A水平 按試劑盒說(shuō)明配置系列標(biāo)準(zhǔn)樣品并制作濃度曲線。PANC-1細(xì)胞缺氧培養(yǎng)12、24、48 h后，收集細(xì)胞。按試劑盒說(shuō)明配制待測(cè)樣品(與標(biāo)準(zhǔn)樣品等體積)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，計(jì)算出待測(cè)樣品m6A水平。

1.7.2 比色法檢測(cè)METTL3敲減后PANC-1細(xì)胞總m6A水平 針對(duì)METTL3的小干擾RNA(siRNA)由吉瑪公司設(shè)計(jì)和合成，METTL3序列如下：正向引物 5′-GCACUUGGAUCUUCGGAAUTT-3′，反向引物 5′-AUUCCGAAGAUCCAAGUGCTT-3′。METTL3Scramble-序列：正向引物 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向引物 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。病毒包裝及轉(zhuǎn)染同步驟“1.5.2”。對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染METTL3-siRNA 隨機(jī)序列，處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染METTL3-siRNA。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)敲低效率。低氧及常氧條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞48 h，比色法檢測(cè)敲低METTL3后細(xì)胞總m6A水平的影響，方法同步驟“1.7.1”。

1.8 檢測(cè)METTL3敲減后PANC-1細(xì)胞中TWIST的表達(dá)

1.8.1 qRT-PCR檢測(cè)METTL3敲減后TWISTmRNA的表達(dá) PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后缺氧培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。使用Lighter Cycle-DNA Master SYBR Green Ⅰmixture(瑞士 Roche Applied Science公司)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)置如下：95 ℃ 3 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)。為確保擴(kuò)增的特異性，每對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物都進(jìn)行熔解曲線和電泳分析。TWIST引物序列：正向引物 5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，反向引物 5′-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3′。

1.8.2 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)METTL3敲減后TWIST的表達(dá) 對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染METTL3-siRNA 隨機(jī)序列，處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染METTL3-siRNA。低氧條件下培養(yǎng)，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)METTL3敲減后TWIST蛋白表達(dá)，方法同步驟”1.3”。

1.8.3 MeRIP-qPCR檢測(cè)METTL3敲減后TWISTm6A的表達(dá) 每組取30 μL Protein A/G PIUS-Agarose與適量的抗體混勻，于4℃旋轉(zhuǎn)混勻6 h左右；每組準(zhǔn)備2皿細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，紫外線照射固定細(xì)胞；使用預(yù)先冰浴冷卻的PBS洗細(xì)胞2次，收集細(xì)胞沉淀；將裂解液加入細(xì)胞沉淀中，充分裂解。加入裂解液后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入準(zhǔn)備好的瓊脂糖珠-抗體混合液中，于4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻過(guò)夜。將混勻液于4 ℃，1 000 r/min離心2 min，棄上清液；用冰浴冷卻的低鹽漂洗液洗瓊脂糖珠2次，每次5 min，冰上或4 ℃進(jìn)行，1 000 r/min離心2 min，棄上清液。隨后再用高鹽漂洗液(300 mmol/L的NaCl)洗瓊脂糖珠2次，每次5 min，冰上或4 ℃進(jìn)行，1 000 r/min離心2 min，棄上清液。qRT-PCR檢測(cè)步驟：用蛋白酶K溶液重懸瓊脂糖珠，55 ℃消化10 min，再用常規(guī)的Trizol法抽提RNA，用乙醇沉淀。 使用Lighter Cycle-DNA Master SYBR Green Ⅰmixture(瑞士Roche Applied Science公司)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。方法同步驟“1.8.1”。

1.8.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)METTL3過(guò)表達(dá)后TWIST的表達(dá)METTL3-WT引物序列：正向引物 5′-CGGAATTCGCCACGAGACTGAAATGT-3′，反向引物 5′-GCGTCGACATAGATTCTTAGGTTTAGAGATGAT-3′，組裝至pcDNA3.1載體。METTL3-MUT sgRNA序列：正向引物 5′-GAAATTAATACGACTCACTATAggagcgcaccatcttcttcaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCG-3′， 反向引物5′-GAA ATTAATACGACTCACTATAGggtggtgcagatgaacttcaGTT TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAG TCCG-3′，插入至pst1374-nirs-flag-cas9載體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)TWIST的表達(dá)，方法同步驟“1.3”。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧誘導(dǎo)TWIST高表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞EMT

胰腺癌PANC-1細(xì)胞低氧培養(yǎng)后，隨著缺氧時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)印跡顯示TWIST蛋白的表達(dá)水平逐漸增加(圖1)。低氧培養(yǎng)48 h后，免疫熒光顯示PANC-1細(xì)胞中TWIST蛋白，間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、波形蛋白的表達(dá)顯著升高，同時(shí)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下降(圖2)，表明低氧誘發(fā)胰腺癌細(xì)胞EMT。

*：P<0.01，與0 h比較

圖2 免疫熒光檢測(cè)低氧下PANC-1細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)和TWIST表達(dá)(×100倍)

蛋白質(zhì)印跡顯示，在常氧下轉(zhuǎn)染TWISTsiRNA后，PANC-1細(xì)胞中TWIST蛋白表達(dá)下降了60%，低氧濃度下表達(dá)下降了80%。在常氧濃度下，敲低TWIST表達(dá)后E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平上升約2倍，α-SMA表達(dá)下降50%，波形蛋白表達(dá)下降約70%；在低氧濃度下，敲低TWIST表達(dá)恢復(fù)了E-鈣黏蛋白的表達(dá)增加了2倍，而α-SMA及波形蛋白的表達(dá)部分受到抑制，分別下降50%和75%，提示下調(diào)TWIST可以削弱低氧引起的EMT(圖3)。以上結(jié)果表明，低氧可以通過(guò)誘導(dǎo)TWIST高表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞EMT。

#：P<0.01

2.2 低氧誘導(dǎo)METTL3表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的m6A水平升高

qRT-PCR及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，低氧處理的PANC-1細(xì)胞中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.01)表達(dá)逐漸增加，48 h后增加約4倍(圖4A、B)；比色法檢測(cè)細(xì)胞總m6A水平，結(jié)果顯示隨著低氧處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞中總m6A水平升高(P<0.01)，48 h后增加80%(圖4C)。

蛋白質(zhì)印跡顯示，轉(zhuǎn)染METTL3siRNA后，PANC-1細(xì)胞中METTL3蛋白表達(dá)下降40%(圖4D)。在常氧濃度下，敲低METTL3后，細(xì)胞中總的m6A相對(duì)表達(dá)水平輕度下降；在低氧濃度下，敲低METTL3后可顯著抑制低氧誘導(dǎo)的m6A水平升高，下降了45%(圖4E)。以上結(jié)果表明，低氧誘導(dǎo)METTL3表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的總m6A水平升高。

A、B： qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)低氧條件下METTL3表達(dá)；C：低氧下細(xì)胞總m6A水平檢測(cè)；D、E： 構(gòu)建METTL3穩(wěn)定敲低的PANC-1細(xì)胞及其對(duì)照，常氧和低氧條件下檢測(cè)METTL3敲低效率和細(xì)胞總m6A水平。*：P<0.05，#：P<0.01

2.3 METTL3依賴于m6A修飾調(diào)控TWIST蛋白表達(dá)

qRT-PCR顯示，低氧條件下，穩(wěn)定敲低METTL3后，PANC-1細(xì)胞中TWISTmRNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變(圖5A)；但蛋白質(zhì)印跡顯示，低氧條件下敲低METTL3后TWIST蛋白表達(dá)下降了60%(圖5B)。MeRIP-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，低氧條件下敲低METTL3后， PANC-1細(xì)胞中TWISTmRNA m6A水平降低了20%(圖5C)。蛋白質(zhì)印跡顯示，在PANC-1細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染METTL3-WT或METTL3-MUT后，METTL3-WT組TWIST蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高2.2倍，而METTL3-MUT組無(wú)顯著變化(圖5D)。以上結(jié)果提示：METTL3依賴于m6A修飾調(diào)控TWIST蛋白表達(dá)。

A、B： METTL3穩(wěn)定敲低的PANC-1細(xì)胞低氧處理48 h后，TWIST mRNA和蛋白表達(dá)；C： MeRIP-qPCR檢測(cè)TWIST RNA m6A水平；D：在PANC-1細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染METTL3-WT或METTL3-MUT質(zhì)粒，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)TWIST表達(dá)。*：P<0.05，#：P<0.01

3 討論

EMT指上皮到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，它賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，不僅在發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，而且還參與各種病理及生理過(guò)程[4]。E-鈣黏蛋白表達(dá)的缺失被認(rèn)為是EMT的關(guān)鍵步驟。EMT誘導(dǎo)基因可以分為兩組，Snail家庭轉(zhuǎn)錄因子1、E盒結(jié)合鋅指蛋白1(ZEB1)、核轉(zhuǎn)錄因子E47和Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子8(KLF8)可以與E-鈣黏蛋白的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其表達(dá)，TWIST等則間接抑制E-鈣黏蛋白的活性。EMT關(guān)鍵的步驟是上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化同時(shí)伴有極性的喪失，α-SMA和波形蛋白是經(jīng)典的間充質(zhì)標(biāo)志物。本研究中免疫熒光及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，低氧處理胰腺癌細(xì)胞，TWIST蛋白表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下降而α-SMA和波形蛋白明顯增加。而同等低氧條件下敲低TWIST表達(dá)后，E-鈣黏蛋白表達(dá)部分恢復(fù)而α-SMA和波形蛋白表達(dá)部分得到抑制，說(shuō)明低氧可能通過(guò)調(diào)節(jié)TWIST的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌EMT。結(jié)果提示TWIST在胰腺惡性腫瘤適應(yīng)低氧環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。

微環(huán)境低氧是腫瘤的基本特征，在多種類(lèi)型惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，且與其他類(lèi)型實(shí)體瘤相比，胰腺癌組織含氧量最低[3]。我們進(jìn)一步觀察胰腺癌細(xì)胞中低氧條件是否影響METTL3表達(dá)及細(xì)胞總 m6A水平，結(jié)果顯示低氧處理后，RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高；同時(shí)胰腺癌細(xì)胞總m6A水平顯著升高，常氧條件下敲低METTL3表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞m6A水平輕度下降，而低氧條件下敲低METTL3則顯著抑制m6A水平升高。這提示低氧可以通過(guò)誘導(dǎo)METTL3表達(dá)，顯著升高胰腺癌細(xì)胞的m6A水平。

為了研究胰腺癌細(xì)胞在低氧條件下，METTL3 m6A修飾功能與TWIST蛋白表達(dá)之間是否存在關(guān)系，我們構(gòu)建了METTL3敲低PANC-1細(xì)胞系，結(jié)果顯示低氧條件下敲低胰腺癌細(xì)胞METTL3表達(dá)顯著降低TWISTmRNA的m6A水平，抑制TWIST蛋白表達(dá)，但對(duì)TWISTmRNA表達(dá)水平無(wú)顯著影響；過(guò)表達(dá)METTL3顯著上調(diào)TWIST蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)入METTL3突變質(zhì)粒未見(jiàn)相關(guān)改變。結(jié)果提示METTL3依賴m6A修飾調(diào)控TWIST蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，低氧通過(guò)誘導(dǎo)METTL3表達(dá)，以m6A依賴的方式調(diào)控TWIST蛋白表達(dá)。然而METTL3調(diào)節(jié)TWIST蛋白的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。