NFATc1對糖尿病動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠腸道菌群的影響

劉嘉， 孫振， 侯麗娜， 錢勇江， 邵晨， 袁偉， 王中群

(江蘇大學附屬醫(yī)院心內科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

隨著社會經濟的發(fā)展和人們膳食結構的改變，糖尿病發(fā)病率呈爆炸式增長，我國糖尿病患者數(shù)量現(xiàn)已位居世界首位，占全球總數(shù)的1/4以上[1-2]。心血管疾病是糖尿病患者致死致殘的主要原因[3]。動脈粥樣硬化是一種好發(fā)于大中等動脈、以脂質蓄積和炎癥反應為特征的血管壁慢性病變，是心血管疾病的主要病理基礎?，F(xiàn)有證據(jù)表明糖尿病環(huán)境增加罹患動脈粥樣硬化的風險[4]，然而其中機制目前尚未明確。因此深入探討糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)病機制具有十分重要的現(xiàn)實意義。人體內共生著大量的微生物，包括細菌、病毒、古生菌和真菌等，其中大多數(shù)定植于胃腸道。腸道微生物構成腸道黏膜屏障，對機體正常生理功能起著重要的維持作用，包括調節(jié)營養(yǎng)物質的吸收和代謝，避免糖脂代謝紊亂[5-6]，協(xié)助免疫組織成熟[7-9]，甚至影響神經生理及行為功能[8]等。最新研究結果表明，腸道菌群及其代謝產物如短鏈脂肪酸、氧化三甲胺、膽汁酸和脂多糖等，可作用于膽固醇代謝和免疫系統(tǒng)影響斑塊的形成和破裂，影響動脈粥樣硬化的發(fā)病進程[10]。既往研究表明活化T細胞核因子胞漿1型(nuclear factor of activated T-cells， cytoplasmic 1,NFATc1)在糖尿病患者血清中的含量顯著升高[11]，且活化T細胞核因子(NFAT)在糖尿病小鼠的主動脈中被選擇性激活[12]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NFATc1作為成骨破骨平衡的“分子開關”，影響了糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)生[13]。改變破骨細胞和成骨細胞的相對活性，可導致骨量減少甚至發(fā)生骨質疏松，這些疾病均與腸道微生態(tài)的紊亂密切相關[14]。但現(xiàn)有研究未見有關NFATc1影響腸道菌群結構的報道，因此本研究擬構建糖尿病動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型， 觀察NFATc1對糖尿病動脈粥樣硬化斑塊的影響，運用16S rRNA技術探究NFATc1對腸道菌群綱水平的調節(jié)情況，希冀為防治動脈粥樣硬化提供新的思路和方向。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠高脂飼料成分為10%豬油、4%奶粉、1.5%膽固醇、0.5%膽酸鈉和84%普通飼料，購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物有限公司。NFATc1敲減腺相關病毒(AAV-shNFATc1)及陰性對照腺相關病毒(AAV-negative control)購于生工生物工程(上海)股份有限公司；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊公司)；NFATc1抗體(英國Abcam公司)；β-肌動蛋白抗體(美國Proteintech公司)；羊抗兔二抗(上海泊灣生物公司)；PVDF膜(德國Millipore公司)；蘇木素-伊紅染色(HE染色)試劑盒為索萊寶公司產品；組織包埋盒及載玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司。代謝籠(蘇州澤雅科教實驗設備有限公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；化學凝膠成像分析儀(美國GE Healthcare公司)；BM450A組織包埋機、BM450型組織包埋冷凍臺、PH60型病理組織漂烘儀(常州派斯杰醫(yī)療公司)；手動輪轉式切片機(德國Leica公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 糖尿病動脈粥樣硬化小鼠模型構建和分組

SPF級6周齡雄性ApoE-/-小鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司。自由攝食及飲水1周后，給予小鼠腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素[40 mg/(kg·d)]，連續(xù)5 d。2周后將血糖水平≥300 mg/dL的小鼠隨機分組如下：模型對照組(高脂飲食)、陰性對照組(高脂飲食+尾靜脈注射AAV-negative control)、NFATc1敲減組(高脂飲食+尾靜脈注射AAV-shNFATc1)。每組5只，連續(xù)飼喂8周。

1.3 切片制備

實驗結束后處死小鼠，剝離出主動脈組織，使用4%多聚甲醛固定10 h，將組織置于脫水盒中，依次放入75%、75%、95%、95%乙醇缸內浸泡各 60 min，無水乙醇浸泡30 min(2次)脫水；然后放入二甲苯-無水乙醇等量混合液浸泡60 min、二甲苯浸泡60 min、二甲苯浸泡30 min透明；最后放入恒溫箱中的石蠟-二甲苯等量混合溶液處理30 min，充分融化的純蠟中浸蠟2次，各60 min。隨后調整組織在包埋框的角度，使用包埋機加蠟包埋，并立即放置于-20 ℃冷凍臺上冷卻。待蠟凝固后修整蠟塊，切片機切片，片厚4 μm，將切片漂浮于漂片機溫水上展平，用載玻片將組織撈起，放入烘箱烤片。待水烤干，蠟烤化后，取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HE染色觀察小鼠主動脈斑塊形成情況

使用常溫所存石蠟切片，脫蠟水化，蘇木素染液染色10 min，自來水沖洗，分化液分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅染液染色1 min，自來水沖洗，自來水浸泡3 min，脫水，透明，封片后，鏡下拍照。利用Image J軟件分析測量各組照片，計算各組小鼠主動脈斑塊相對面積(%)：主動脈斑塊面積/血管面積。

1.5 蛋白質印跡檢測小鼠主動脈NFATc1蛋白表達

提取小鼠主動脈組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。進行10% SDS-PAGE，70 V 120 min分離所提取的蛋白樣品，350 mA 100 min電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，與一抗NFATc1、β-肌動蛋白(稀釋比均為1 ∶ 1 000)孵育過夜，TBST洗3次，羊抗兔二抗孵育1 h，TBST洗3次，化學發(fā)光系統(tǒng)顯示圖像，使用Image J軟件分析蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.6 小鼠糞便樣本收集

使用無菌代謝籠分離小鼠糞便和尿液，糞便排入干燥容器中，使用無菌鑷子夾取中段新鮮糞便約0.2 g，放入無菌凍存管，管壁標記樣品名稱，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，所有樣本收集完畢后干冰寄送至深圳微生太公司進行高通量測序。

1.7 小鼠糞便DNA抽提和PCR擴增

根據(jù)糞便基因組DNA提取試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min(ABI GeneAmp?9700型PCR儀)。擴增體系：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，338F引物(5 μmol/L)0.8 μL，806R引物(5 μmol/L)0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板10 ng，補雙蒸水至20 μL。

1.8 Illumina MiSeq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(美國Axygen Biosciences公司)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(美國Promega公司)進行定量檢測。根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建文庫。利用MiSeq PE300平臺進行測序。以99%的序列相似度作為操作分類單元(OTUs)劃分閾值，根據(jù)聚類結果對OTUs進行物種注釋，得到物種信息后進行Alpha多樣性分析，對綱水平(Class)豐度排名前20的物種進行生物信息學分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

應用微生物組成分析(analysis of composition of microbiomes, ANCOM)分析菌群在組間的差異顯著性，由ANCOM分析生成的W值是某一菌群在組間檢驗中存在顯著差異的個數(shù)，高W值表明拒絕無效假設的可能性更大。clr值指某一菌群相對豐度的組間差異程度，絕對值越高代表相對豐度差異越大。

2 結果

2.1 NFATc1敲減效率驗證

將NFATc1敲減腺相關病毒尾靜脈注射進小鼠體內，并高脂飲食飼喂8周后， 蛋白質印跡結果顯示，主動脈中NFATc1蛋白表達明顯低于陰性對照組(t=6.62，P<0.05)，而模型對照組和陰性對照組小鼠主動脈NFATc1的表達無明顯差異(t=0.35，P>0.05)。見圖1。

*：P<0.05，與陰性對照組比較

2.2 敲減NFATc1后糖尿病ApoE-/-小鼠主動脈HE染色結果

HE染色結果表明，糖尿病ApoE-/-小鼠高脂飼喂8周后主動脈粥樣斑塊形成，且結構發(fā)生改變：中膜平滑肌層變薄，內膜受損且有大量膽固醇結晶堆積，纖維帽下聚集大量炎癥細胞。結果表明成功構建糖尿病動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型。與陰性對照組相比，NFATc1敲減組斑塊相對面積明顯減小(t=8.28，P<0.05)。而模型對照組與陰性對照組間主動脈斑塊相對面積差異無統(tǒng)計學意義(t=0.20，P>0.05)。見圖2。

A：HE染色(×100)；B：主動脈斑塊定量分析；*：P<0.05，與陰性對照組比較

2.3 16S rRNA PCR擴增產物鑒定結果

陰性對照組與NFATc1敲減組小鼠糞便樣品的16S rRNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示。兩組小鼠糞便共10個樣本，PCR產物目的條帶大小正確，濃度適中，可以進行下一步的測序。

圖3 小鼠糞便樣本16S rRNA PCR擴增產物質檢結果

2.4 Alpha多樣性稀釋曲線

如圖4所示，兩組樣本的Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線趨于平緩，測序深度已經基本覆蓋到樣品中的所有物種，可以認為增加測序深度并不能獲得更多新的OTUs，說明測序數(shù)據(jù)量達到要求，測序結果已足以反映樣本中物種群落的豐富度及多樣性，可以進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

A：菌群豐度指數(shù)稀釋曲線；B：菌群多樣性指數(shù)稀釋曲線

2.5 NFATc1對糖尿病動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠綱水平腸道菌群相對豐度的影響

Illumina MiSeq測序結果顯示，糖尿病動脈粥樣硬化小鼠糞便中共檢測到17個菌綱，見圖5。陰性對照組中相對豐度大于0.1%的菌綱有9個，其中相對豐度大于10%的菌綱有4個，分別是產芽胞菌綱(32.93%)、放線菌綱(25.55%)、芽孢桿菌綱(19.44%)、梭菌綱(14.09%)，它們是該組小鼠糞便中的優(yōu)勢菌群。NFATc1敲減組小鼠糞便中產芽胞菌綱的相對豐度增至78.82%，而上述其余3個菌綱相對豐度均較陰性對照組下降。提示NFATc1對小鼠綱水平腸道菌群的主要構成無影響，但菌群相對豐度發(fā)生了變化。

A：各樣本在綱水平的菌群相對豐度(相對豐度前20的物種)；B：陰性對照組與NFATc1敲減組在綱水平的菌群相對豐度；在綱水平沒有注釋的序列被歸為“其他”一類。個別未譯英文菌名暫無合適中文譯名

基于ANCOM方法對組間OTUs進行差異顯著性分析，見圖6。在NFATc1敲減后，芽孢桿菌綱(W值=5，clr=-2.27)相對豐度水平降低，且具有較高的顯著性差異。產芽胞菌綱(W值=2，clr=1.39)、β-變形菌綱(W值=2，clr=1.54)、柔膜菌綱(W值=2，clr=1.61)相對豐度升高，TM7_3(W值=2，clr=-1.41)相對豐度降低，以上菌綱在組間均有顯著差異。而放線菌綱(W值=1，clr=-0.59)及紅蝽菌綱(W值=1，clr=0.89)雖在組間具有顯著性差異，但權重較小。

圖中每一個點代表一個菌群，“其他”類菌群未參與該分析。W值越高，組間的差異顯著性越高；clr值的絕對值越高代表相對豐度差異越大。

3 討論

糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)病機制十分復雜，不僅與糖脂代謝紊亂有關，還涉及氧化應激、炎癥反應、胰島素以外的激素變化等[15]。進一步研究顯示腸道菌群亦參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。腸道菌群被認為是調節(jié)人體健康的“第二大基因組”，并被稱作虛擬的“內分泌器官”，其產生的分子能夠參與宿主的多種生理代謝過程[16]。腸道菌群失調導致腸黏膜通透性增加，革蘭陰性菌外膜上脂多糖成分進入血液循環(huán)。脂多糖可直接與免疫細胞表面Toll樣受體4結合，抑制肝X受體，減少三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)和三磷酸腺苷結合盒轉運體G1(ABCG1)的表達[17]。其次，脂多糖還可間接觸發(fā)腫瘤壞死因子-α、白介素-1β的釋放，抑制膽固醇逆轉運，進而促進泡沫細胞的形成[18]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的代謝產物氧化三甲胺可縮小體內膽汁酸池，導致膽固醇外流減少，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展[19-20]。此外，研究發(fā)現(xiàn)約51.5%的患者動脈粥樣硬化斑塊中檢測出細菌DNA，其中部分來自腸道或口腔[21]。細菌進入動脈粥樣硬化斑塊的機制之一是巨噬細胞在上皮細胞層(如腸道、口腔和肺)的吞噬作用。被感染的巨噬細胞擴散并遷移進入內膜，轉化為含膽固醇的泡沫細胞[22]。這表明菌群本身及其代謝產物可能直接參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。Hooper等[23]研究表明接種擬桿菌能促進宿主回腸脂肪吸收關鍵酶的表達，增強腸細胞對脂質的吸收，加重脂肪沉積。而Turnbaugh等[24]發(fā)現(xiàn)，無菌鼠無論接種擬桿菌或厚壁桿菌，體脂肪均有所增加，只是厚壁桿菌影響更大。近年來研究顯示，灌胃擬桿菌可降低ApoE-/-小鼠糞便和血漿中脂多糖濃度，并延緩小鼠血管動脈粥樣硬化的發(fā)生[25]。以上研究表明，改變腸道微生物的構成會影響包括脂質代謝在內的多種過程，但研究結果不一致的原因可能在于腸道各菌群發(fā)揮作用的復雜性。

NFATc1作為NFAT轉錄因子家族的重要成員之一，調節(jié)破骨細胞的形成和分化，維持骨組織動態(tài)平衡[26]。抑制NFATc1轉錄活性，可延緩小鼠骨質疏松的發(fā)展[27]。最新研究發(fā)現(xiàn)骨質疏松癥患者腸道菌群多樣性降低且發(fā)生失衡，特別是乳桿菌和產丁酸菌的豐度較低，致病性細菌梭狀芽胞桿菌豐度增加[28]。一項橫斷面研究顯示[29]，與健康人群相比，牙周炎患者牙齦組織中NFATc1表達顯著升高，且表達量隨著疾病嚴重程度的增加而增加。同時牙周炎患者的腸道菌群豐度有所下降，其中厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門比例增加，而擬桿菌門比例下降[30]。Lucas等[31]對小鼠喂食短鏈脂肪酸丙酸酯和丁酸酯，結果顯示小鼠的骨含量顯著增加。且體外研究發(fā)現(xiàn)二者顯著抑制了破骨細胞信號轉導成分NFATc1的表達。這些實驗表明NFATc1與腸道菌群的構成密切相關。Sun等[32]發(fā)現(xiàn)，腸道菌群中的產芽胞菌綱在治療非酒精性脂肪肝中發(fā)揮了重要作用。間歇性禁食后產芽胞菌綱顯著富集，腸道微生物豐富度增加，有助于預防肥胖癥和多種代謝相關性疾病[33]。而梭菌綱是唯一一種在肥胖動物腸道中顯著增加的菌群[34]。本研究在干擾NFATc1表達后，敲減組的特征微生物產芽胞菌綱相對豐度顯著增加，而放線菌綱、芽孢桿菌綱、梭菌綱相對豐度降低。結果提示NFATc1可致糖尿病小鼠腸道菌群的相對豐度發(fā)生改變，其中產芽胞菌綱及梭菌綱可能與脂質代謝相關。然而，NFATc1是否介導產芽胞菌綱或腸道菌群代謝產物，影響糖尿病動脈粥樣硬化進程，還需要進一步的實驗加以研究。

綜上所述，本研究結果表明，干預NFATc1的表達后糖尿病ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積明顯減小，同時腸道菌群中產芽胞菌綱的相對豐度明顯增加，放線菌綱、芽孢桿菌綱、梭菌綱的相對豐度降低。以上結果提示NFATc1可改變糖尿病動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠腸道菌群的相對豐度，而動脈粥樣硬化的進程可能與腸道菌群的相對豐度變化相關，這將為糖尿病大血管并發(fā)癥的防治提供新的靶點。