中藥血清藥理方法學(xué)的研究概況

柯 瑋 朱建華

（皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)三系，安徽 蕪湖 241002）

由于中藥粗制劑中含有大量雜質(zhì)，另外，中藥作用人體后發(fā)揮作用的具體成分不詳，若直接加入體外反應(yīng)系統(tǒng)，其pH、鞣質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等許多非特異性理化因素，都會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果；另外，中藥口服后其有機(jī)成分在胃腸內(nèi)會(huì)受到消化液和腸道菌微生態(tài)轉(zhuǎn)化，特別是苷類化合物，其糖基使之不易從腸道吸收，腸道菌使苷分解，釋放的苷元易被腸道吸收而成為真正產(chǎn)生藥效的物質(zhì)。所以中藥直接用于體外實(shí)驗(yàn)因其科學(xué)性較差，難以得到認(rèn)可。而血清藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法克服了這些問(wèn)題。血清藥理學(xué)是指將中藥、中藥復(fù)方以及不明成分的藥物給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后，采集動(dòng)物血清，用此含藥成分的血清作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中研究其藥理作用的實(shí)驗(yàn)方法[1]。血清藥理學(xué)是日本學(xué)者Hiroko Iwama在1984年第一屆和漢醫(yī)學(xué)會(huì)上首次提出的，近年來(lái)，我國(guó)越來(lái)越多的中藥專家應(yīng)用此法來(lái)研究中藥藥理作用。從而避免了中藥體外用藥的干擾，直接反映中藥及其代謝產(chǎn)物的藥理作用。本文就關(guān)于血清藥理實(shí)驗(yàn)的報(bào)道加以綜述。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠、大鼠，也可用兔、豚鼠等。不同種屬的動(dòng)物血清成分不同，所以應(yīng)盡量選用與人類生物學(xué)特性近似的物種[2]，從而縮小動(dòng)物血清和人類血清在生理、生化等狀態(tài)下的差異，減少因種屬差異而造成的免疫反應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[3]。在進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量采用同種血清，可以避免了多種血清的干擾[4]。由于動(dòng)物在生理狀態(tài)下與病理狀態(tài)下對(duì)藥物消化吸收不同，對(duì)藥物生物轉(zhuǎn)化不同，藥物的作用下機(jī)體反應(yīng)不同，即正常動(dòng)物采集的血清和病理狀態(tài)動(dòng)物采集的血清的作用可能存在差異。有學(xué)者用兩種方法制備的清肝化瘀方藥含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響表明，發(fā)現(xiàn)病理狀態(tài)下和正常情況下大鼠制備的含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用不一樣，病理大鼠的含藥血清還能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。因此，需要根據(jù)各實(shí)驗(yàn)要求選用不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和不同狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[5]。

2 給藥劑量

含藥血清加入到體外的實(shí)驗(yàn)后，濃度會(huì)被稀釋，導(dǎo)致可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或者陰性的結(jié)果，當(dāng)然，也并不能排除是否系由于藥物濃度過(guò)低造成的。給藥劑量=臨床常用量×動(dòng)物等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)的稀釋度。這一方法的可以部分的彌補(bǔ)含藥血清在體外反應(yīng)系統(tǒng)中的被稀釋。缺點(diǎn)是血藥濃度并不能與給藥劑量呈等倍數(shù)增加，對(duì)藥味多、劑量大的復(fù)方在給動(dòng)物灌服時(shí)可能有困難，達(dá)不到公式所要求的量；將含藥血清制成凍干粉，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌服，使之能夠在動(dòng)物血中達(dá)到需要的濃度。這一方法可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，相應(yīng)的提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血中的含藥濃度，并且有利于血清的貯藏保存。體內(nèi)給藥并不是劑量越大所得血清藥理效應(yīng)越好[6]，而是要考慮到臨床實(shí)際確定給藥劑量，隨意增加給藥劑量是非常危險(xiǎn)的[7]。也有些人認(rèn)為究竟采取什么劑量，最好是通過(guò)預(yù)試驗(yàn)解決[8]。

3 給藥方案

在進(jìn)行中藥血清藥理實(shí)驗(yàn)之前必須確定合適的給藥方案[9]，是否禁食、給藥的次數(shù)以及給藥間隔都將會(huì)對(duì)血藥濃度產(chǎn)生影響。

食物可以改變胃腸道理化性質(zhì)，影響其功能狀態(tài)，減慢藥物在體內(nèi)的吸收過(guò)程，使血藥濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求的時(shí)間難以確定，甚至達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。因此在進(jìn)行血清藥理實(shí)驗(yàn)之前必須考慮是否禁食以及禁食時(shí)間的長(zhǎng)短。一般情況下，應(yīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食8～12h，保持空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免其他因素帶來(lái)的干擾。崔曉蘭等發(fā)現(xiàn)3次給藥法，給家兔灌服桂枝湯，單次給藥后1、2、3h所采集的含藥血清無(wú)抑制副流感病毒致細(xì)胞病變的作用，但每日給藥1次，連續(xù)3d，末次給藥2h后的血清，有明顯抑制副流感病毒致細(xì)胞病變的作用。還有人提出每日1次連續(xù)7～10d給藥，每隔一個(gè)半衰期給藥一次，連續(xù)4～6次。采用中藥血清藥理學(xué)方法開(kāi)展研究，有必要先確定受試制劑的給藥方案，這樣所取含藥血清才能較好反映藥物所具有作用[10]。這些方法的目的都是使血藥濃度達(dá)到穩(wěn)定再采血，從而便于藥物機(jī)制的研究。

4 采血時(shí)間

如果能在給藥的峰濃度時(shí)間段內(nèi)采血效果最好，能夠避免由于有效物質(zhì)尚未吸收或代謝殆盡而造成的假陰性結(jié)果。但是不同的藥物甚至同一藥物的不同有效成分，它們達(dá)到峰濃度的時(shí)間都不盡相同[11]。因此，采血很難有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。有研究者認(rèn)為多數(shù)藥物的達(dá)峰時(shí)間在藥后1～2h，采血時(shí)間定為給藥后2h。也可在末次連續(xù)給藥后2次，間隔1h，第2次藥后1h采血。李儀奎則認(rèn)為每日給藥2次，連續(xù)3d，末次給藥1h后采血。部分學(xué)者以含藥物血清抗血小板釋放5-HT和阻滯內(nèi)皮細(xì)胞鈣通道作用為指標(biāo)，探討影響中藥血清藥理學(xué)方法開(kāi)展的重要因素——制備含藥物血清的采血時(shí)間，并進(jìn)行了時(shí)效關(guān)系的研究。結(jié)果顯示：給藥后30min采血所得血清作用最佳。達(dá)到近似穩(wěn)態(tài)血藥濃度時(shí)采血制備的含藥血清用來(lái)檢驗(yàn)的效果最好[12]；最可靠的方法是先通過(guò)對(duì)少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，將不同時(shí)間的采集的含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，再確定采血時(shí)間；梅彥芳[13]建議：含中藥或復(fù)方的血清制備，采血時(shí)間的確定還須考慮復(fù)方的劑型以及機(jī)體功能的狀態(tài)，并結(jié)合其藥效動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)確定。

5 含藥血清的處理與保存

一般處理血清的方法有丙酮法、乙醇法、放置56℃水浴中、滅活30min。其中，水浴滅活最常用。血清中原來(lái)的蛋白質(zhì)、生物堿等生物活性物質(zhì)，它們會(huì)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生影響，血清滅活后可減少干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響[14]。推薦進(jìn)行體外抗病毒實(shí)驗(yàn)時(shí)宜采用滅活血清較好[15]，以含桂枝湯兔血清經(jīng)56℃，滅活30min后用于實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)正常血清及含藥血清滅活后對(duì)病毒致細(xì)胞病變的抑制作用較滅活前均有所降低。滅活的血清對(duì)實(shí)驗(yàn)的不同影響，還取決于實(shí)驗(yàn)對(duì)象的選擇，以及檢驗(yàn)的目標(biāo)[16]。可見(jiàn)，正常血清所含的抗體、補(bǔ)體等成分本身就有抗病毒作用。然而，用含頭風(fēng)飲（TFY）血清研究血清滅活的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，以抗血小板釋放5-HT和阻滯內(nèi)皮細(xì)胞鈣通道作用為指標(biāo)，血清滅活后使其藥效作用非但沒(méi)有降低，反而有所提高，但差異不明顯，說(shuō)明在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，血清在滅活對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不大，可能與實(shí)驗(yàn)所選動(dòng)物、藥材有關(guān)系。然而這3種滅活方法對(duì)不同實(shí)驗(yàn)，效果可能不同，周芝蘭等人以豚鼠離體氣管螺旋條抗乙酰膽堿及組織胺活性差異為指標(biāo)，對(duì)血清預(yù)處理方法進(jìn)行了比較，研究結(jié)果顯示，經(jīng)處理的血清均可非常明顯地降低血清的抗乙酰膽堿作用，并且經(jīng)丙酮處理的能明顯降低血清的抗組胺作用，經(jīng)56℃滅活血清不能降低其抗乙酰膽堿及抗組胺作用。還應(yīng)注意，血清經(jīng)長(zhǎng)期的保存低溫保存后藥效會(huì)受到影響，所以進(jìn)行血清藥理實(shí)驗(yàn)時(shí)盡可能的使用保存時(shí)間較短的含藥血清或剛剛制備的含藥血清。

6 血清添加量

在用血清藥理實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行藥理學(xué)觀察時(shí)，必須注意到含藥血清加入體外反應(yīng)系統(tǒng)后，藥物濃度將被稀釋。在體外反應(yīng)系統(tǒng)中適當(dāng)?shù)脑黾友逄砑恿渴强梢缘模x擇種屬越接近動(dòng)物的血清，添加的濃度可以越高，添加濃度為100%時(shí)，即在純血清內(nèi)培養(yǎng)。隨著反應(yīng)體系中含藥物血清加入量的逐漸增加，其藥理效應(yīng)曲線是呈正態(tài)分布狀，說(shuō)明并不是添加量越大越好，血藥濃度并不能與給藥劑量呈倍數(shù)的提高，給藥劑量加倍，血藥濃度不一定加倍。而且還應(yīng)考慮到受灌胃體積的限制。盡管不同的動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的影響是不同的，在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候，只選用一種血清也是可以的，既提供營(yíng)養(yǎng)同時(shí)有作為藥物的載體，而且可以避免多種血清產(chǎn)生的干擾。

7 小 結(jié)

血清藥理學(xué)是一門較新的體外實(shí)驗(yàn)方法，它優(yōu)于傳統(tǒng)的將中藥粗制劑直接加入反應(yīng)系的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)中藥藥理機(jī)制的研究具有推動(dòng)作用，為中藥復(fù)方的研究方法開(kāi)辟了中藥研究的新思路。盡管這些年人們做了大量研究，但由于起步較晚，還有許多問(wèn)題，如給藥方案、采血時(shí)間、血清的滅活等都需要探索和完善。中藥血清藥理學(xué)是針對(duì)中藥及其復(fù)方的中藥藥理研究方法，用含藥血清代替了傳統(tǒng)的中藥煎劑或提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其科學(xué)性更強(qiáng)，可信度更高。相信隨著這門技術(shù)的日益成熟，中藥血清藥理學(xué)將會(huì)很好的發(fā)揮在科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中的作用。

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