原發(fā)性肝癌患者癌組織NLRP3炎性小體表達狀況研究

陳 維，魏 濤，楊 嵐，伍小敏

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、病死率高等特點，其5 a生存率僅有25%左右。HCC發(fā)病具有隱匿性，研究顯示HCC能逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，使得早期不容易被發(fā)現(xiàn)，到晚期則治療療效差，是目前威脅人類健康最大的惡性腫瘤之一[1,2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域富含膿素亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域3(nucleotide-binding oligomerization domain leucine rich repeats containing pyrin domain 3, NLRP3)炎性小體是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，能夠識別各種不同的炎癥刺激信號，并激活相關(guān)的炎癥反應(yīng)[3]。目前，有研究表明NLRP3炎性小體與細胞凋亡有一定的聯(lián)系。NLRP3炎性小體的接頭蛋白為凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白(apoptosis associated speck like protein containing,ASC)，主要由胱天蛋白酶招募結(jié)構(gòu)域(caspase activation and recruitment domain, CARD)和膿素結(jié)構(gòu)域(pyrin domin，PYD)組成。這兩種蛋白主要作用是連接上游 NLRP3 和下游的 Caspase-1。上游的NLRP3過表達可以在一定程度上調(diào)節(jié)下游的Caspase-1表達，引起細胞凋亡[4]。故NLRP3炎性小體危險信號傳感器可以觸發(fā)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[5]。NLRP3炎性小體可以通過激活蛋白gasdermin D，參與原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)生和發(fā)展[6]。NLRP3可能通過TLR4信號途徑參與了原發(fā)性肝癌(primary liver cancer， PLC)的免疫過程[7]。下調(diào)波形蛋白(vimentin)/NLRP3蛋白表達可以抑制肝癌細胞凋亡，實現(xiàn)抑制肝癌的發(fā)展[8]。但目前關(guān)于PLC患者癌組織NLRP3炎性小體表達及其臨床意義的研究尚不充分，因此本研究檢測了PLC患者癌組織NLRP3炎性小體表達情況，并探討了其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年1月～2018年1月我科收治的PLC患者34例，男20例，女14例；平均年齡為(41.08±8.11)歲；所有患者均符合2000年楊秉輝編寫的《原發(fā)性肝癌診斷標準》[9]。排除標準：(1)具有嚴重的心、肝、腎功能不全和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；(2)合并自身免疫功能缺陷性疾??；(3)合并嚴重的感染。另選擇同期因肝膽管結(jié)石而切除的肝組織標本30例作為對照組。

1.2 肝組織NLRP3表達檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法，分別取肝癌組織和肝組織，標本脫蠟、入水、PBS沖洗，加入抗原修復(fù)液，滴加正常山羊血清封閉液，加入抗NLRP3 抗體(稀釋倍數(shù)1:500，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司)，使用DAB 顯色試劑盒(購自美國Santa Cruz Biotechnology公司)顯色，復(fù)染切片后晾干，在光學(xué)顯微鏡(WMJ-9688，上海無陌光學(xué)儀器有限公司)下觀察，并計數(shù)細胞陽性率，計數(shù)100個細胞，計算細胞陽性率(%)=陽性細胞總數(shù)/細胞總數(shù)。

1.3 肝組織NLRP3 mRNA檢測 采用熒光定量 PCR 法檢測肝組織相關(guān)蛋白mRNA水平，使用Trizol 提取總 RNA，在分光光度計(SPECTRONIC 200，美國Thermo公司)下測定RNA純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 鏈。以此鏈為模板，使用定量PCR儀(美國 ABI 公司)擴增，95 ℃預(yù)變性2 min；95℃保持8 s，58 ℃保持 35 s，72 ℃保持40 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因水平。β-actin：上游引物：5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’，下游引物：5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’；NLRP3：上游引物：5’-GCAGCAAACTGGAAAGGAAG-3’，下游引物：5’- CTTCTCTGATGAGGCCCAAG-3’?！鰿t=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因(n)；△△Ct值=△Ct(n)-△Ct(1)；計算出2-ΔΔCt值為基因相對水平。

1.4 血清細胞因子水平檢測 采用ELISA法檢測血清白細胞介素-6 (interleukin- 6, IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α，上海撫生生物科技有限公司)。

1.5 肝組織NLRP3炎性小體、鈣依粘連蛋白(E-cadherin)、波形蛋白和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)蛋白表達檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法，取肝癌組織，使用胰蛋白酶(美國Biosharp公司)消化，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉下，室溫封閉2 h。先后分別滴加抗鈣依粘連蛋白抗體(稀釋倍數(shù)1:500，美國Santa Cruz Biotechnology公司)、抗波形蛋白 抗體(稀釋倍數(shù)1:500，美國Santa Cruz Biotechnology公司)、抗半胱氨酸蛋白酶-1和羊抗鼠IgG蛋白(貨號：2018630258，武漢華聯(lián)科有限公司)，孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后，行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝組織NLRP3炎性小體表達情況 在正常對照組和肝癌組均有NLRP3炎性小體表達，但肝癌組織細胞NLRP3炎性小體陽性率為76.5%，顯著高于正常對照組的23.3%(P<0.05，圖1)。

圖1 兩組肝組織NLRP3炎性小體表達情況 (SP，400×)A：正常肝組織NLRP3炎性小體呈低表達；B：肝癌組織NLRP3炎性小體呈強陽性表達

2.2 兩組肝組織NLRP3 mRNA水平比較 肝癌組織NLRP3 mRNA水平顯著高于正常對照組(P<0.05，表1)。

表1 兩組肝組織NLRP3 mRNA水平比較

2.3 兩組外周血細胞因子水平比較肝癌患者血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著高于正常人(P<0.05，表2)。

表2 兩組外周血細胞因子水平比較

2.4 兩組肝組織相關(guān)蛋白表達水平比較 經(jīng)免疫印記檢測，正常對照組肝組織E-cadherin蛋白水平為(1.2±0.15)，顯著高于肝癌組【(0.41±0.04)，P<0.05】，而Caspase-1和Vimentin蛋白水平為(0.21±0.03)和(0.42±0.06)，顯著低于肝癌組【(1.49±0.12)和(1.51±0.14)，P<0.05，圖2】。

圖2 兩組肝組織相關(guān)蛋白表達比較

3 討論

腫瘤的侵襲及遷移是重要的惡性生物學(xué)特征。有效調(diào)控去腫瘤細胞的運動能力可有效抑制腫瘤的擴散。細胞的侵襲和遷移受到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchyml transition，EMT)的調(diào)節(jié)[10]。EMT是指上皮細胞能暫時喪失細胞極性獲得間質(zhì)細胞移動的能力。腫瘤細胞能夠通過細胞極性喪失，改變自身細胞形態(tài)，與其他細胞分離[11]。EMT能力決定著腫瘤細胞的侵襲能力。腫瘤細胞EMT能力越強說明腫瘤處于活化狀態(tài)，其擴散和轉(zhuǎn)移的可能性也較大[12，13]。同時，通過下調(diào)細胞粘附因子E-鈣粘蛋白的表達[14]，將角蛋白細胞骨架變?yōu)椴ㄐ渭毎羌?，促進細胞穿透胞間連接，增強細胞的侵襲能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常肝組，肝癌組患者癌組織波形蛋白蛋白表達顯著增強，而E-鈣粘蛋白表達顯著降低，說明細胞間的黏附能力顯著下降，腫瘤的侵襲能力增強。這可能是因為NLRP3炎性小體下游相關(guān)基因可能會影響到黏附蛋白的表達，使得細胞間的黏附能力降低，使得腫瘤的侵襲遷移能力顯著增強。研究表明，NLRP3炎性小體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，并且其表達水平的提高可誘導(dǎo)胃腫瘤細胞的遷移和侵襲[16]，與本研究得出的結(jié)論相一致。

炎癥反應(yīng)的標志性細胞因子包括炎癥因子和抑炎癥因子，其中IL-6、TNF-α、IL-1是重要的促炎性細胞因子，它們主要由單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞和非免疫細胞等分泌，是炎癥的重要介導(dǎo)物質(zhì)[17,18]。目前，研究較多的促炎性細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等；抗炎性細胞因子則包括IL-4、IL-10、IL-1等。大部分TNF-α、IL-1、IL-6由單核細胞和巨噬細胞分泌，少量由非免疫細胞分泌，是引起炎癥的重要物質(zhì)[18]。研究表明，NLRP3 炎性小體是主要的炎癥調(diào)控元件，可以調(diào)控炎癥因子的表達和分泌[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高，說明肝癌患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)會顯著升高，這可能是因為NLRP3炎性小體激活可使caspase-1 激活進而導(dǎo)致促炎細胞因子 如IL-1β等的過度生成，最終導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)擴大。

正常的凋亡是細胞的重要生理學(xué)特征，但腫瘤細胞的凋亡會受到抑制。調(diào)控腫瘤細胞的凋亡也是治療腫瘤的重要方法之一。腫瘤的凋亡受到相關(guān)基因的調(diào)控，Caspase家族基因是常見的調(diào)控基因之一[20]。在Caspase家族中，Caspase-1是Caspase家族的啟動子。當細胞接收到凋亡信號后，會激活Caspase家族中的凋亡啟動子Caspase-3，并激活凋亡執(zhí)行子Caspase-9，使caspase-9自身裂解產(chǎn)生pro-caspase-9，同時會發(fā)生反饋調(diào)節(jié)促進生成pro-caspase-3，反過來再次促進有活性的Capsase-1的產(chǎn)生，并引發(fā)凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。

Caspase家族的Caspase-1蛋白表達與NLRP3炎性小體關(guān)系密切。NLRP3炎性小體的接頭蛋白為ASC，主要由CARD和PYD組成，這兩種蛋白連接主要作用是連接上游 NLRP3 和下游的 Caspase-1，上游的NLRP3過表達可以在一定程度上調(diào)節(jié)下游的Caspase-1的表達。當NLRP3過表達時，會使得下游的Caspase-1表達，啟動Caspase家族的凋亡啟動子，促進腫瘤細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織caspase-1蛋白表達顯著升高，說明升高的NLRP3炎性小體可以促進細胞的凋亡。這可能是因為上游的接頭蛋白為ASC，后者與NLRP3結(jié)合導(dǎo)致鏈接下游的PYD減少，使得caspase-1增多。

綜上所述，原發(fā)性肝癌患者癌組織NLRP3炎性小體呈現(xiàn)高表達，其水平上調(diào)可能會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)并促進肝癌細胞的遷移。因此，NLRP3炎性小體或許可作為肝癌治療調(diào)控的靶點之一。