人EFTUD2基因靶向小分子化合物篩選細胞模型的建立*

田安然，徐瑞瑞，胡平平，李毓雯，朱傳龍

延伸因子結(jié)合蛋白2(elongation factor Tu GTP-binding domain-containing 2，EFTUD2)是一種剪接體GTP酶，參與機體許多重要的生物學過程，例如針對肝炎病毒入侵時的先天免疫應(yīng)答[1,2]、癌癥的發(fā)生[3,4]、神經(jīng)發(fā)育[5]、細胞的成熟分化[6]和顱面畸形[7,8]等。EFTUD2在肝炎病毒感染過程中發(fā)揮不可或缺的調(diào)控作用。然而，針對EFTUD2的靶向細胞模型還較少。因此，本研究旨在利用HepG2細胞構(gòu)建以EFTUD2為靶點的化合物篩選細胞模型，不僅為后續(xù)篩選可上調(diào)EFTUD2表達的化合物奠定研究基礎(chǔ)，而且也為開發(fā)治療慢性乙型肝炎新型藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 HepG2細胞株由哈佛大學Wenyu Lin教授提供。LV6載體、pGag/Pol、pRev、pVSV-G質(zhì)粒(上海吉瑪基因股份有限公司)；高純度質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(天根生化)；中量質(zhì)粒抽提試劑盒(杭州愛思進生物技術(shù)有限公司)；XbaI和BamHI DNA內(nèi)切酶(加拿大MBI Fermentas公司)；嘌呤霉素(生工)；青霉素和鏈霉素(上海碧云天生物有限公司)；Polybrene(美國Sigma-Aldrich公司)；熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國promega公司)；ClonExpress? Entry One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。AIRTECH 超凈工作臺(蘇州安泰公司)；GloMaxTM20/20 發(fā)光檢測儀，GloMaxTM96 微孔板發(fā)光檢測儀(美國promega公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 取HepG2細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)加入抗生素(青霉素100 u/ml，鏈霉素0.1 mg/ml)。細胞的培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5% CO2。當單層貼壁細胞生長密度約80%時進行傳代。

1.3 LV6慢病毒載體構(gòu)建和包裝 LV6載體含有EF-1a啟動子，嘌呤霉素篩選標記，無熒光標簽。通過融合PCR技術(shù)將hEFTUD2pro-0.5kb基因片段和來自LV17載體的熒光素酶基因片段組成目的片段Epro0.5-LUC。在37℃恒溫下，用XbaI和BamHI DNA內(nèi)切酶酶切LV6載體2 h。隨后，對酶切條帶用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，并回收LV6載體條帶。將回收好的Epro0.5-LUC目的片段利用克隆試劑盒重組到線性化的LV6載體中，構(gòu)建成LV6-Epro0.5-LUC穿梭質(zhì)粒。配置好反應(yīng)體系并混勻(5 × CE Entry緩沖液4 μl；LV6載體1 μl；Epro0.5-LUC 2 μl；Exnase Entry 2 μl；DEPC水11 μl)，于37℃環(huán)境下反應(yīng)30 min。在反應(yīng)結(jié)束后，迅速取出反應(yīng)管，轉(zhuǎn)移到低溫水浴中，冷卻后置4℃冰箱備用。待293T細胞生長較好時，用胰酶消化離心，用完全培養(yǎng)基重懸并接種到15 cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度約為70%～80%。重組慢病毒穿梭質(zhì)粒LV6-Epro0.5-LUC，與包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev和pVSV-G共轉(zhuǎn)染293T細胞72 h，收集病毒液并進行滴度檢測。

1.4 嘌呤霉素藥物篩選濃度的確定 按照5×104細胞/孔，將HepG2細胞接種于24孔板，每孔液體總量為500μl，均勻鋪板后，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。每孔加入嘌呤霉素，終濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3和2.4 μg/ml。維持嘌呤霉素濃度培養(yǎng)細胞，并根據(jù)細胞生長狀態(tài)適時換液，連續(xù)觀察6 d，選擇能在6 d內(nèi)完全殺死細胞的最低濃度作為嘌呤霉素的工作濃度。

1.5 感染慢病毒構(gòu)建細胞模型及其篩選 對HepG2細胞進行計數(shù)，按照1×104細胞/孔將HepG2細胞接種于48孔板，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，進行慢病毒感染。每孔加入5 μg/mL 的 Polybrene，對病毒原液按照MOI值100感染HepG2細胞，8 h后更換新鮮含10% FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。再將每孔的培養(yǎng)基更換成含嘌呤霉素的選擇性培養(yǎng)基(含1.0μg/ml嘌呤霉素)，每隔2～3 d換液一次，維持嘌呤霉素濃度在選擇壓力下持續(xù)培養(yǎng)2 w左右。

1.6 單克隆細胞的獲取 成功感染病毒細胞能夠繼續(xù)存活，待長出多克隆細胞后，進行熒光素酶活性檢測。選擇熒光素酶活性較強的細胞繼續(xù)擴大培養(yǎng)。將擴大培養(yǎng)的多克隆細胞株消化離心，制備成單細胞懸液，計數(shù)后將細胞數(shù)調(diào)制為5000細胞/ml，再逐級稀釋成1000細胞/ml、100細胞/ml、50細胞/ml、20細胞/ml、10細胞/ml和5細胞/ml。按不同細胞數(shù)梯度分別接種96孔板，每孔加入細胞懸液100μl，使每孔含有一個細胞，維持嘌呤霉素濃度不變。待細胞貼壁后，在顯微鏡下觀察并將含有單個細胞的培養(yǎng)孔進行標記，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待長出單克隆細胞株后(約15～20 d)，挑取生長狀態(tài)良好的5株細胞進行測序檢驗，并留取適量相應(yīng)的細胞進行熒光素酶檢測。選擇測序結(jié)果正確且熒光讀值最高的細胞株繼續(xù)擴大培養(yǎng)。同時，維持嘌呤霉素濃度。篩選出具有正常細胞周期且能穩(wěn)定傳代20代以上的單克隆細胞株，大量凍存，將獲得的細胞命名為Epro-LUC-HepG2細胞。

2 結(jié)果

2.1 LV6-Epro0.5-LUC慢病毒載體構(gòu)建成功 通過融合PCR技術(shù)，將前期實驗篩選出的具有最強啟動活性的hEFTUD2pro-0.5kb啟動子序列與螢火蟲熒光素酶報告基因整合成融合基因，通過限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI雙酶切將融合基因同源重組進LV6載體中，構(gòu)建LV6-Epro0.5-LUC穿梭質(zhì)粒。酶切穿梭質(zhì)粒并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)測序比對，驗證正確無誤后，與包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)一起轉(zhuǎn)染293T細胞，進行慢病毒包裝并進行滴度檢測。LV6-Epro0.5-LUC載體圖譜見圖1。利用瓊脂糖凝膠電泳和測序鑒定重組慢病毒載體(圖2、圖3)，將成功獲得的慢病毒命名為LV6-Epro0.5-LUC慢病毒。

圖1 LV6-Epro0.5-LUC載體圖譜

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定LV6-Epro0.5-LUC重組載體 采用Xba I和BamH I雙酶切構(gòu)建LV6-Epro0.5-LUC重組載體，在Epro0.5-LUC融合基因中存在一個BamH I酶切位點，在雙酶切重組載體進行電泳鑒定時，產(chǎn)生了3個酶切條帶

圖3 測序鑒定重組LV6-Epro0.5-LUC載體

2.2 嘌呤霉素藥物篩選濃度的確定結(jié)果 在HepG2細胞，摸索嘌呤霉素藥物篩選濃度，連續(xù)觀察6 d加入嘌呤霉素培養(yǎng)的細胞并拍照記錄(圖4)，能在6 d內(nèi)完全殺死細胞的最低濃度被確定為1.0 μg/ml，并以該濃度作為后續(xù)單克隆細胞篩選時所用的嘌呤霉素的濃度。

圖4 嘌呤霉素致死濃度的篩選

2.3 獲得Epro-LUC-HepG2單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株 在LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2細胞，感染后8 h更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入終濃度為1.0μg/ml的嘌呤霉素進行藥物篩選。維持藥物選擇壓力持續(xù)培養(yǎng)2 w左右，用長出的多克隆細胞通過有限稀釋法挑選出5株單克隆細胞株。對5株細胞進行測序驗證，驗證目的序列是否克隆入細胞基因組，并利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測5株單克隆細胞株的熒光素酶活性，選擇熒光素酶活性最高的細胞株進行擴大培養(yǎng)(圖5)，結(jié)果成功建立了單克隆細胞模型，將其命名為Epro-LUC-HepG2細胞。

圖5 各克隆細胞株的熒光素酶活性的比較 在挑出的5株單克隆細胞中，第4株細胞生長狀況較差，被棄用

3 討論

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒。HBV不直接殺死被感染的肝細胞。當它被識別為外來抗原時，宿主免疫系統(tǒng)就會鎖定并破壞受感染的肝細胞，從而導(dǎo)致肝組織的炎癥和壞死[9]。慢性HBV感染是一個重大的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織在2015年估計，約有2.57億人(全球人口的3.5%)慢性感染HBV，其中大多數(shù)人群出生于廣泛使用乙肝疫苗之前。除此之外，長期感染HBV可導(dǎo)致肝臟纖維化和硬化，進一步會引起25%～40%HBV攜帶者發(fā)生失代償期肝病和/或肝細胞癌[10]。

傳統(tǒng)的治療HBV感染的藥物主要是核苷(酸)類似物和干擾素-α(IFN-α)[11]。前者主要是靶向在干擾HBV生命周期中的逆轉(zhuǎn)錄過程而發(fā)揮作用，其優(yōu)點是良好的耐受性和強效的抗病毒活性[12]。但是，它們不能完全抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA合成[13]。細胞因子介導(dǎo)的治療例如IFN-α，能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，通過誘導(dǎo)各種干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)表達來發(fā)揮抗病毒作用。有研究提示聚乙二醇化干擾素的使用會產(chǎn)生較多的副作用，比如流感樣綜合征、體質(zhì)量減輕、中性粒細胞減少和血小板減少等，可能增加感染和出血風險。因此，被禁用于晚期肝病以及出現(xiàn)白細胞減少和嚴重血小板減少的患者[14]。所以，要根據(jù)患者的基本情況來考慮是否進行IFN-α治療，也使IFN-α的應(yīng)用受到一定的限制。因此，迫切需要更加安全、有效、便捷的治療方法，讓盡可能多的慢性乙型肝炎患者受益。

U5小核糖核蛋白是剪接體激活的關(guān)鍵部分，而EFTUD2是U5小核糖核蛋白的核心成分，它屬于一種GTP酶，能夠與GTP/GDP結(jié)合[15-17]，這一特性對于維持剪接體的正常功能至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)EFTUD2基因是肝細胞癌患者的一個預(yù)后獨立預(yù)測因子，其表達水平較高的患者總體生存時間和腫瘤復(fù)發(fā)時間明顯較短[4]。本課題組前期的研究已經(jīng)證明EFTUD2在丙型肝炎病毒感染過程中能夠發(fā)揮抗病毒作用，主要通過其pre-mRNA剪切作用來調(diào)控下游的調(diào)節(jié)因子，例如視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I和黑色素瘤分化相關(guān)基因5，進而激活干擾素調(diào)節(jié)因子3，促進ISGs的表達[2]。所以，EFTUD2基因在機體對抗肝炎病毒感染過程中具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，對其進行多方面的深入研究將為治療病毒性肝炎提供更多思路和選擇。

人類原代肝細胞是HBV復(fù)制研究的金標準。然而，由于人肝臟組織的來源有限和存在遺傳多樣性，并且這類細胞容易喪失其本身特性和持續(xù)支持HBV復(fù)制的能力，使得該細胞模型的有效性和可用性受到了不少限制[18,19]。HepG2細胞是一種人肝癌細胞系，最初來源于一名15歲男性高分化肝癌患者[20]，它在感染HBV后能夠支持HBV的復(fù)制。因此，是HBV相關(guān)研究較為理想的細胞系。除了在病毒性肝炎研究領(lǐng)域被廣泛使用外，HepG2細胞已經(jīng)被成熟應(yīng)用于藥物的毒性試驗、自噬損傷和細胞代謝通路等其他方面的研究。此外，由HepG2衍生而來的細胞，如HepG2.2.15和HepG2-NTCP細胞也在各種病毒性肝炎研究中得到廣泛使用。

本研究根據(jù)前期實驗的結(jié)果，選擇具有較強啟動活性的hEFTUD2pro-0.5kb啟動子片段，通過構(gòu)建含有目的啟動子片段和Luciferase基因片段的慢病毒載體，將兩種基因片段克隆入HepG2細胞基因組，篩選出陽性克隆株并進行測序驗證。由于LV6重組載體中插入了Luciferase基因片段，因此能夠利用熒光素酶基因報告系統(tǒng)來檢測細胞內(nèi)熒光素酶基因的表達，從而可以間接地反映該啟動子片段是否能夠有效啟動EFTUD2基因表達。該細胞系含有人EFTUD2基因啟動子片段，更加便于后續(xù)尋找能夠上調(diào)EFTUD2表達的化合物的研究。