消積抑癌方對Lewis肺癌荷瘤小鼠MMP-2的影響

鄭 茜，劉遠(yuǎn)婷，丁甜甜，李 慧

(新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊830000)

肺癌是臨床常見的一種癌癥，在全球范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率及死亡率均居于首位[1]。我國肺癌在男性惡性腫瘤中發(fā)病率居首位，在女性惡性腫瘤中肺癌的發(fā)病率居于第二位[2]。目前臨床常采用放化療、手術(shù)、靶向治療、生物治療等多種綜合方法治療肺癌，以提高其療效，但患者5年內(nèi)的生存率仍<14%，且大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，已喪失手術(shù)治療的機(jī)會，以姑息性治療為主[3]。雖然治療晚期肺癌臨床常采用化療治療，但是化療誘發(fā)的一系列毒副作用仍無法避免。近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷進(jìn)步，中醫(yī)藥在治療肺癌中取得了重要的作用[4]。消積抑癌方具有化痰散結(jié)、益氣扶正、清熱解毒、活血消積、以毒攻毒之功效，且經(jīng)筆者多年研究已證實消積抑癌方能夠有效改善肺癌患者的臨床癥狀，提高患者預(yù)后水平[5]。因此，本研究將消積抑癌方用于治療Lewis肺癌荷瘤小鼠，以觀察消積抑癌方對Lewis肺癌荷瘤小鼠MMP-2的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與細(xì)胞：購于青島實驗動物中心(證書編號：SCXK2014-001)雄性6～8周的C57BL/6小鼠，SPF級，平均體重為(20±2)g，共100只雄性小鼠，實驗動物使用許可證：SYXK(黑)2016004。購自美中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生產(chǎn)的Lewis肺癌細(xì)胞株。

1.1.2 藥物：消積抑癌方，組方為當(dāng)歸、川芎、乳香、沒藥、紅花、赤芍、甲珠、丹參各30 g，五靈脂60 g、仙鶴草、丹皮、白鮮皮、蛇莓、透骨草、青黛各60 g，莪術(shù)、苦參、山慈菇、商陸、延胡索、浙貝母、烏梅、蜂房各120 g，蜈蚣40條，全蝎、蟲、拳參各40 g，冰片9 g。由新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院中藥房提供。46°白酒500 ml(天池特曲濃香型46°)，將冰片溶入白酒中制備成冰片酒。將消積抑癌外用方中的藥物用破壁機(jī)研成細(xì)粉,用46°白酒調(diào)和成膏狀再消毒滅菌裝瓶封制成的外敷制劑。消積抑癌內(nèi)服方：將消積抑癌方加水煎煮二次，每次加10倍量水，提取2 h，濾過后合并濾液，制成5.25 g(生藥)/ml，以上藥品由我院提供。

1.1.3 試劑：蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Hclone high glicose DMEM、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)；美國Gibco公司生產(chǎn)的胰蛋白酶(批號20150808225)；美國RD公司生產(chǎn)的血清MMP-2、VEGF、HIF-1α，ELISA試劑盒；南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的血清IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2試劑盒。

1.1.4 儀器：大連格瑞萊儀器有限公司生產(chǎn)的AR224電子天平；重慶光電儀器有限公司生產(chǎn)的DMIL-RFI熒光倒置相差顯微鏡；上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)的低溫高速離心機(jī)；日本Olympus公司生產(chǎn)的倒置相差顯微鏡；美國力高公司生產(chǎn)的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱；上海凈化設(shè)備廠生產(chǎn)的SSB-2超凈臺；日本LIMITED公司生產(chǎn)的電子天平；德國Greiner公司生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶；ABI公司生產(chǎn)的qRT-PCR儀；Leica公司生產(chǎn)的組織包埋機(jī)及石蠟切片機(jī)；日本光電株式會社生產(chǎn)的MEK-6318型全自動血細(xì)胞分析儀；美國艾森生物公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀、濕轉(zhuǎn)電泳槽(Cavoy)、MiniP-4電泳槽；Thermo公司生產(chǎn)的MultiSkan3酶標(biāo)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立Lewis肺癌荷瘤鼠模型：將Lewis肺癌細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代，取生長良好的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用計數(shù)板計數(shù)，將濃度調(diào)整至1×107個/ml以供注射。取60只C57BL/6小鼠，將2×106個(0.2 ml)Lewis肺癌細(xì)胞接種于每只小鼠右側(cè)腋部皮下，每天檢查腫瘤生長情況，全程均采取無菌操作，接種8 d后開始實驗，在造模過程中小鼠無死亡。

1.2.2 分組：未造模的20只小鼠作為空白對照組(空白組)。將80只荷瘤小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為四組，每組20只進(jìn)行標(biāo)號。荷瘤組：荷瘤對照組；內(nèi)服組：給予消積抑癌方內(nèi)服；外敷組：給予消積抑癌方外敷方治療；聯(lián)合組：給予消積抑癌方內(nèi)服聯(lián)合消積抑癌方外敷治療。

1.2.3 給藥方式：根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[6]計算小鼠給藥劑量，以人與小鼠體表面積折算等效劑量的小鼠表面外敷劑量及面積。荷瘤組：每天瘤體表面外敷生理鹽水調(diào)和的面糊，加熱至30 ℃使用，3次/d，每次30 min，連續(xù)30 d；內(nèi)服組：給予消積抑癌方內(nèi)服，根據(jù)成人(60 kg)體重劑量換算給藥劑量的比例[7]，3次/d，連續(xù)30 d；外敷組：給予消積抑癌方外敷治療，將“消積抑癌外用方”方中的藥物用破壁機(jī)研成細(xì)粉,用46°白酒調(diào)和成膏狀再消毒滅菌裝瓶封制成的外敷制劑。小鼠按照0.79 ml/20 g體重標(biāo)準(zhǔn)外敷藥物，每天瘤體表面外敷“消積抑癌外用方”膏劑，加熱至30 ℃使用，3次/d，每次30 min，連續(xù)30 d；聯(lián)合組：給予消積抑癌方內(nèi)服聯(lián)合外敷治療，參考上面內(nèi)服組和外敷組方法。上述各組小鼠均雄性，分籠飼養(yǎng)，濕度為70%～80%，溫度為20～24 ℃，自由飲水、攝食。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率，對比各組免疫器官重量及血清基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、干擾素(IFN)-γ、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-2(IL-2)水平。

1.3.1 腫瘤體積、癌重抑瘤率：接種第8天后，每隔7天用游標(biāo)尺對腋下腫瘤最大長徑(a)和短徑(b)進(jìn)行測量，第4次至30 d時測量，對腫瘤體積進(jìn)行計算，平均瘤體積=a×b2/2；腫瘤精準(zhǔn)稱重量，對抑癌率進(jìn)行計算，抑癌率=(1-用藥組種瘤平均重量/空白組腫瘤平均重量)×100%。

1.3.2 免疫器官重量的測定：所有小鼠均在末次給藥后12 h將眼球摘除后采血并處死，將胸腺、脾臟摘取稱重，并計算胸腺、脾臟指數(shù)。

1.3.3 免疫指標(biāo)檢測：MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2各指標(biāo)水平均采用ELISA法檢測，需根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率比較 見表1。第7天、第14天、第21天及第30天，聯(lián)合組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率均明顯低于荷瘤組、內(nèi)服組、外敷組；內(nèi)服組、外敷組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率均明顯低于荷瘤組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；內(nèi)服組與外敷組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率比較

2.2 各組免疫器官重量比較 見表2?？瞻捉M、聯(lián)合組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與荷瘤組、內(nèi)服組、外敷組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；內(nèi)服組、外敷組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與荷瘤組、空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；荷瘤組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；外敷組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與內(nèi)服組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組免疫器官重量比較(mg/g)

2.3 各組免疫指標(biāo)比較 見表3?？瞻捉M與聯(lián)合組MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；內(nèi)服組、外敷組MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2水平與荷瘤組、空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；荷瘤組MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2水平與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；外敷組MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2水平與內(nèi)服組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組免疫指標(biāo)比較

3 討 論

在中醫(yī)學(xué)中并無肺癌這一病名，其根據(jù)肺癌的臨床癥狀將其歸屬于“咯血” “虛勞” “息賁” “肺積”等范疇[6]。該病病位在肺，在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中肺為華蓋，為嬌臟，易受內(nèi)外病邪侵襲。該病病因病機(jī)為正氣先虛，邪毒乘機(jī)入侵，造成肺氣郁結(jié)，肅降失司，日久痰濁內(nèi)生，搏結(jié)日久，結(jié)而成積，蘊(yùn)而成癌，而發(fā)病。故治則為扶正益氣、活血化瘀散結(jié)、清熱解毒[8-9]。消積抑癌方中當(dāng)歸活血化瘀、補(bǔ)血止痛；川芎具活血行氣，祛風(fēng)止痛；乳香活血行氣、通經(jīng)止痛、消腫生??；沒藥活血止痛、消腫生??；紅花活血祛瘀通經(jīng)；赤芍清熱涼血、活血祛瘀；五靈脂活血止痛、化瘀止血；莪術(shù)活血化瘀、行氣止痛；苦參清熱燥濕、平喘祛痰；山慈菇有清熱散毒、軟堅化結(jié)；透骨草祛風(fēng)除濕、舒筋活血及散瘀止痛；全蝎息風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛；蜈蚣具有通絡(luò)止痛、清熱解毒、活血化瘀之功效；甲珠具有消腫排膿、通經(jīng)活絡(luò)之功效；蟲逐瘀破積、通絡(luò)理傷、消腫止痛；商陸消腫散結(jié)解毒；延胡索止痛活血利氣；青黛清熱涼血解毒；拳參清熱止瀉、涼血止血、鎮(zhèn)驚息風(fēng)；仙鶴草活血化瘀、收澀補(bǔ)虛；丹皮清熱涼血、活血化瘀；白鮮皮清熱燥濕、瀉火解毒；丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰；浙貝母散瘀清熱、消痰散結(jié)；烏梅具有斂肺止咳生津；蜂房祛風(fēng)止痛,攻毒消腫；蛇莓清熱解毒，清熱利濕，散結(jié)消腫；冰片清熱止痛、防腐生??；白酒通絡(luò)止痛。諸藥合用共達(dá)收澀補(bǔ)虛、活血化瘀、清熱涼血、行氣止痛、軟堅化結(jié)之功效。因此，本研究將探討消積抑癌方對Lewis肺癌荷瘤小鼠MMP-2的影響。

本研究結(jié)果顯示，第7天、第14天、第21天及第30天，聯(lián)合組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率均明顯低于荷瘤組、內(nèi)服組、外敷組；內(nèi)服組、外敷組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率均明顯低于荷瘤組；內(nèi)服組與外敷組Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積、癌重、抑癌率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明消積抑癌方外敷和內(nèi)服聯(lián)合使用能夠有效抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤體積，控制癌重，提高抑癌率，且用藥時間越長，則腫瘤體積、癌重則變化越明顯。李賽凱等[10]通過研究證實，中藥方劑明顯抑制Lewis肺癌皮下移植瘤小鼠的腫瘤生長。孫國鈞等[11]通過研究證實，自擬益氣消征方各劑量組對小鼠Lewis肺癌移植瘤有較好的抑制率,從而起到抗腫瘤的臨床效果。張素芳等[12]通過研究證實，中藥方劑能夠有效抑制腫瘤生長，提高免疫能力，延長生存期。以上均證實中藥方劑能夠有效抑制腫瘤生長，與本研究結(jié)果相似。

在機(jī)體內(nèi)抗腫瘤免疫的主力是細(xì)胞免疫，IL-2與T細(xì)胞功能密切相關(guān)，且是免疫調(diào)節(jié)中最重要的細(xì)胞因子之一，能夠激活促進(jìn)T細(xì)胞體內(nèi)增殖，使T細(xì)胞增強(qiáng)，對NK細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)，從而分化和增殖B細(xì)胞，產(chǎn)生LAK細(xì)胞，以發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[13-14]。TNF-α對T細(xì)胞具有激活作用，能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)白細(xì)胞殺死微生物。TNF-α能夠誘導(dǎo)血管豐富的腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死和抑制其生長，與機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)密切相關(guān)，有一定的抗腫瘤作用[15]。IL-10能夠促使NK細(xì)胞活性降低，有利于腫瘤細(xì)胞生長；另外，IL-10能夠增高引流淋巴管腫瘤的數(shù)量和對腫瘤細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生抑制作用，從而為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供機(jī)會[16]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與腫瘤新生血管生成具有一定的相關(guān)性，且血管生成與血管生成抑制因子和血管生成促進(jìn)因子密切相關(guān)。IFN-γ是機(jī)體內(nèi)外的免疫細(xì)胞因子之一，具有抑制血管生成、抗血管雙重活性及抗腫瘤的作用[17]。HIF-1α是一種氧依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，若機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)缺氧情況，其在缺氧環(huán)境下能夠在腫瘤細(xì)胞表達(dá)中升高，促使腫瘤血管生成和瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移增加，導(dǎo)致預(yù)后不佳[18]。VEGF是一種腫瘤細(xì)胞血管生長的調(diào)控因子，其與受體相結(jié)合后，會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖及轉(zhuǎn)移，能夠促使形成腫瘤新血管；VEGF水平與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[19]。MMPs是一類鋅蛋白酶，具有分解細(xì)胞外基質(zhì)組分的作用，MMP-2屬于MMPs家族中的一種，具有降解膠原蛋白、基質(zhì)、突破基質(zhì)屏障的作用，且能夠促使腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移或生成新生血管等方式增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。已有相關(guān)研究證實，MMP-2在肺癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞的生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切[20]。

因此，本研究對消積抑癌外敷方對Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫器官和免疫功能進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，空白組、聯(lián)合組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2水平與荷瘤組、內(nèi)服組、外敷組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明消積抑癌方外敷和內(nèi)服聯(lián)合使用不會對Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫器官造成影響，且能夠降低MMP-2、VEGF、HIF-1α、IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2水平，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能。究其原因如下：消積抑癌方中當(dāng)歸具有抗炎、鎮(zhèn)痛、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等作用；川芎具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴(kuò)血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用；乳香具有調(diào)節(jié)人體脂質(zhì)代謝、抗?jié)儭⒄{(diào)節(jié)人體免疫力等多種作用；沒藥具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血脂、黏膜保護(hù)、抗組胺、抗微生物、抗腫瘤等多種藥理作用；紅花具有抗血栓、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能的作用；赤芍有抑制血小板和紅細(xì)胞聚集、抗凝和抗血栓、抗動脈粥樣硬化、保護(hù)心臟和肝臟、抗腫瘤等作用；莪術(shù)具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗菌、抗病毒、抗化療、抗白血病、治療嬰兒腹瀉,促進(jìn)機(jī)體免疫力,改善胃動力等作用；苦參具有抗腫瘤、抗病原體等作用；全蝎具有抗腫瘤，提高機(jī)體免疫力的作用；仙鶴草具有抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、降血壓等作用；丹皮具有抗菌消炎、抗過敏,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能,解熱鎮(zhèn)痛,抑制血小板聚集,抗動脈粥樣硬化、清除自由基及保肝利尿等多種藥理作用；烏梅具有抗菌,抗腫瘤,抗過敏,驅(qū)蟲等作用；蜂房、蛇莓具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抑菌、抗炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、降壓以及子宮興奮等作用；冰片有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、保護(hù)心腦、雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、提高其他藥物生物利用等作用。諸藥合用共達(dá)抗腫瘤、提高免疫功能、消炎鎮(zhèn)痛、抗病原體等作用。消積抑癌外敷方中熱力可加速病灶部位藥物吸收，促使中藥有效成分通過血液進(jìn)行機(jī)體，以發(fā)揮作用。因此消積抑癌方內(nèi)服聯(lián)合外敷方可提高Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能。

總而言之，消積抑癌方外敷和內(nèi)服聯(lián)合使用治療Lewis肺癌荷瘤小鼠可有效縮小腫瘤體積，控制癌重，提高抑癌率，對免疫器官不造成影響，提高免疫功能。