大豆球蛋白鼠源多克隆抗體的制備及其免疫學特性鑒定

劉德果，席 俊，王一超，付 揚

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

大豆中蛋白質含量豐富，高達40%，其組成與牛奶蛋白質相似，含有人體所有必需氨基酸，具有很高的營養(yǎng)價值[1]。但是大豆是公認的八大過敏原之一，過敏癥狀一般為皮疹、蕁麻疹、嘔吐、腹瀉等，嚴重時可能出現休克甚至死亡[2]。大豆不僅以食品加工原料或制品出現在人們的餐桌上，而且作為食品添加劑具有改變食品的風味質構或者延長鮮切水果的保質期等功效[3-5]。隨著大豆在食品加工中的應用更加成熟和多樣，大大增加了人們對大豆及其相關制品接觸的機會，導致有大豆過敏癥狀的人數明顯升高[6]。

食物過敏原在食品中通常含量極少，且食品的成分一般比較復雜，大大增加了其檢測難度[7]。大豆過敏原的檢測一般有電泳法、PCR法、質譜法、色譜法、色譜-質譜法和免疫學檢測法[8]。免疫學檢測法具有特異性高、敏感性強和準確性高等優(yōu)點[9]，且容易實現過敏原的現場快速檢測。大豆蛋白根據沉降系數被分為2S、7S、11S、15S[10]，其中7S和11S含量最高[11]，且是致敏性最強的2個組分[12]，11S即是大豆球蛋白的主要組分。作者將提純的天然大豆球蛋白免疫小鼠，制備得到鼠源多克隆抗體血清，為建立其免疫學檢測技術做了鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂豆粉：鯤華生物技術有限公司；SDS-PAGE制備凝膠試劑盒：Biosharp公司；弗氏(不)完全佐劑：Sigma公司；羊抗鼠酶標二抗、瓊脂糖凝膠CL-6B、TMB單組分顯色液：北京索萊寶科技有限公司；Balb/c 雌性小鼠(6～8周齡)：河南省動物實驗中心。

1.2 儀器與設備

VE180 微型垂直電泳槽：上海天能科技有限公司；Multiskan FC 酶標儀、Nanodrop2000/2000C 分光光度計：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫原的制備

參照Deak等[13]的方法分離提純大豆球蛋白，經過堿溶酸沉后得到大豆蛋白粗提物，然后使用瓊脂糖凝膠柱CL-6B進一步分離提純，透析除鹽后測定蛋白濃度，再經SDS-PAGE電泳分析蛋白純度。隨后凍干，-20 ℃儲存。

1.3.2 多抗血清的制備

參照Kim等[14]的方法，免疫對象為6只6～8周齡的Balb/c雌性小鼠，首次免疫將制備的大豆球蛋白與弗氏完全佐劑1∶ 1混合后均質(24 000 r/min，10 min)，隨后背部皮下注射小鼠體內(50 μg/只)。3周后進行二免，二免使用弗氏不完全佐劑，其余同首免。隨后每2周免疫1次。四免1周后，斷尾取血并測定血清的效價及免疫學特性。

表1 免疫程序Table 1 Immunization procedure

1.3.3 多抗血清的免疫學鑒定

用CBS稀釋大豆球蛋白至10 μg/mL，并加入微孔板中(100 μL/孔)，4 ℃靜置10 h，加入PBST，250 μL/孔，輕微振蕩4 min，倒掉并拍干，重復4次。加入5%脫脂奶粉(250 μL/孔)，封上保鮮膜，4 ℃保存。

1.3.3.1 效價測定

參考文獻[15]的方法檢測鼠源多抗血清的效價，吸取多抗血清至準備好的酶標板中(100 μL/孔)，并倍比稀釋，稀釋倍數為200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600，設置陰性與空白對照組，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1∶ 5 000倍稀釋的酶標羊抗鼠抗體(100 μL/孔)，孵育1 h，洗板。加入TMB顯色液(100 μL/孔)，孵育10 min。隨后加入2 mol/L H2SO4(50 μL/孔)，30 s后用酶標儀測定各孔OD(450)。陽性：OD檢測孔/OD陰性孔≥2.1。

1.3.3.2 敏感性測定

參照文獻[16]的方法，選取效價測定中OD(450)最接近1的稀釋倍數作為敏感性測定的多抗血清稀釋倍數，以大豆球蛋白溶液為抑制劑。將100 μL多抗血清和100 μL大豆球蛋白溶液混合后加入備用的微孔板中，隨后步驟同效價測定。計算出多抗血清對β-伴大豆球蛋白的半數抑制濃度，即IC50。

1.3.3.3 特異性測定

采用間接ELISA競爭法，以其他常見的食物過敏原為競爭物，分別測得其與多抗血清之間半數抑制率(IC50)，進一步計算得出各種物質與多抗血清的交叉反應率。選取的常見食品過敏原：β-伴大豆球蛋白、麥朊蛋白、花生蛋白、芝麻蛋白。交叉反應率(CR)=IC50(大豆球蛋白)/IC50(其他過敏原)×100%。

1.3.4 免疫印跡

將脫脂豆粉的電泳凝膠割去2個泳道，組裝入模具后，轉膜，隨后封閉，洗滌(同ELISA)。處理后置于1∶ 5 000倍稀釋的多抗血清中孵化。洗滌后置于同樣倍數稀釋的二抗溶液中孵化。暗室中進行ELC發(fā)光以及顯影、定影。

2 結果與分析

2.1 大豆球蛋白的分離鑒定

由堿溶酸沉法得到的大豆球蛋白經過CL-6B柱層析分離，分離圖譜見圖1，得到2個不重疊的譜峰，1號峰較2號峰出峰時間短，且1號峰更高、峰面積更大。大豆球蛋白分子量較β-伴大豆球蛋分子量更高，且含量更高，所以1號峰為大豆球蛋白，2號峰為β-伴大豆球蛋白。SDS-PAGE電泳圖見圖2。由1、2泳道蛋白與5泳道蛋白比較可知，由堿溶酸沉得到的大豆球蛋白與脫脂豆粉相比，其泳道白條帶清晰單一，表明蛋白質更加純凈。分析其各條帶，1、2泳道中大于50 kDa的條帶明顯減少，這表明β-伴大豆球蛋白含量顯著減少。而且大豆球蛋白的全部亞基均得到較為完整的保留，且酸性亞基含量多于堿性亞基，這與Shirotani等[17]的研究結果相似。1、2泳道和3、4泳道對比來看，3、4泳道上方的多肽鏈含量更少，表明經過CL-6B柱層析處理之后的大豆球蛋白的純度進一步提高。采用BandScan軟件對條帶灰度值進行分析，提純的大豆球蛋白純度均在80%以上，符合動物免疫的要求。

圖1 大豆球蛋白的CL-6B柱層析圖譜Fig.1 Chromatography of soybean globulin by CL-6B column

注：M為Marker，1、2為堿溶酸沉提取的大豆球蛋白，3、4為CL-6B提取的大豆球蛋白,5為脫脂豆粉。圖2 大豆球蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of glycinin

2.2 多抗血清的鑒定

2.2.1 效價鑒定

免疫小鼠個體之間生理狀況、生活環(huán)境、免疫能力等差異對其產生的血清效價有比較明顯的影響。采用間接ELISA分別將四免后得到的6只小鼠的血清進行效價檢測。以OD檢測孔/OD陰性孔≥2.1為陽性的標準，對各小鼠多抗血清效價進行鑒別，結果如表2所示。所有小鼠均對大豆球蛋白產生免疫反應，但血清的效價均有區(qū)別，其中3、5號小鼠的血清效價為1∶ 1 600左右，效價較低不符合實驗要求；剩下4只小鼠的效價均已到達實驗要求(高于1∶ 6 400)，其中1、2號小鼠效價最高(1∶ 12 800)，4、6號小鼠效價次之(1∶ 6 400)。

表2 小鼠四免后血清效價Table 2 Rat serum titer after four immunizations

2.2.2 敏感性鑒定

參考文獻[18]的方法取效價達到要求的小鼠血清進行敏感性鑒定，結果見表3，然后將各小鼠血清的抑制率(B/B0)與lg(競爭蛋白質量濃度)進行線性擬合，隨后利用擬合曲線方程計算IC50。4只小鼠血清抑制率由低到高為1、6、4、2，表明1號小鼠血清最易與大豆球蛋白發(fā)生反應，證明其血清敏感性最高。圖3為各小鼠血清競爭抑制曲線，擬合曲線的線性方程為y=-0.183 1x+1.007 7，決定系數R2=0.994 2。計算得到1號小鼠半數抑制率(IC50)最低，為602 ng/mL。

表3 多抗血清敏感性鑒定Table 3 Identification for the sensitivity of polyclonal antiserum

圖3 多抗血清競爭抑制曲線Fig.3 Competictive inhibition curve of polyclonal antibody

2.2.3 特異性鑒定

選取1號小鼠血清進行特異性鑒定，結果見表4。由表4可知,以麥朊蛋白、芝麻蛋白為競爭抗原與小鼠多抗血清反應，對應的IC50均大于105ng/mL，表明該多抗血清對麥朊蛋白、芝麻蛋白均不敏感。該多抗血清與β-伴大豆球蛋白有輕微的交叉反應(2.4%)，低于陳婧舒[19]制備的多抗血清交叉反應率(3.9%)，可能是由于大豆球蛋白中仍含有少量β-伴大豆球蛋白，免疫過程中引發(fā)了輕微的免疫反應。該多抗血清和花生蛋白有輕微的交叉反應(4.5%)，反映出花生蛋白有小部分結構與大豆球蛋白相似。

表4 多抗血清與其他蛋白的交叉反應率Table 4 Cross-reactivity of the polyclonal antiserum with other proteins

2.2.4 免疫印跡

使用多抗血清進行免疫印跡實驗，結果如圖4所示。由2、3泳道的免疫印跡圖對比1泳道的脫脂豆粉電泳圖可以看出，處于45 kDa以上的β-伴大豆球蛋白部分以及22 kDa附近的大豆球蛋白堿性亞基部分均沒有清晰可供識別的條帶，只有大豆球蛋白A2亞基附近產生了可以被清晰識別的條帶，其他亞基均沒有可被清晰識別的條帶，表明該多抗僅與A2亞基發(fā)生強烈的抗原-抗體反應，這與該多抗與β-伴大豆球蛋白的交叉反應率低的結論相符。該現象還說明僅有A2亞基能引起小鼠較強的免疫反應，大豆球蛋白其他亞基尤其是堿性亞基并不能引起小鼠較強的免疫反應。這與鄭樹貴等[20]所述大豆球蛋白的酸性亞基和堿性亞基致敏性不同，酸性亞基高于堿性亞基的觀點相符。但姚利利等[21]制備的兔源多抗血清與大豆球蛋白的堿性亞基和酸性亞基均有反應，與本實驗獲得的鼠源多抗血清有明顯的區(qū)別，可能是動物種類的不同所導致。

注：M為Marker，1為脫脂豆粉，2、3均為免疫印跡。圖4 多抗血清免疫印跡Fig.4 Western blot of polyclonal antiserum

3 結論

以脫脂豆粉為原料，經過堿溶酸沉和CL-6B凝膠柱層析后得到了純度較高的大豆球蛋白，并以此為免疫原對6只小鼠進行免疫。最終有4只小鼠的多抗血清效價達到要求，其中1、2號小鼠效價最高(1∶ 12 800)；4、6號小鼠效價稍低(1∶ 6 400)。各血清IC50分別為602、3 802、1 584、630 ng/mL，1號小鼠最佳，后續(xù)測得該鼠的多抗血清特異性也較強。在免疫印跡實驗中，發(fā)現該多抗僅與大豆球蛋白的酸性A2亞基反應明顯,與大豆球蛋白的其他亞基均無明顯反應，可能是由于A2亞基含量較高且致敏性較強，而大豆球蛋白其他亞基對小鼠的致敏性特別弱，也可能是由于動物種類差異，小鼠對大豆球蛋白堿性亞基免疫反應不強，其原因尚不明確，有待進一步研究。本研究通過免疫小鼠獲得了效價較高且免疫學特性優(yōu)良的鼠源大豆蛋白多抗血清，為大豆蛋白的免疫學檢測提供了支持。