單側(cè)前庭功能喪失大鼠患側(cè)前庭內(nèi)側(cè)核及小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達△

冷輝 張琦 馬賢德 姜宇晴 石磊 王愛平

前庭及平衡相關(guān)系統(tǒng)與中樞聯(lián)系通路中的任何環(huán)節(jié)受到影響均可出現(xiàn)平衡障礙，常見原因有外傷、感染、前庭老化、應用耳毒性藥物等[1]，此時患者的主觀感受為眩暈。美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)針對60歲以上人群的調(diào)查顯示，患有前庭功能障礙的比例高達64.8%[2]，這無疑增加了社會和家庭的精神和經(jīng)濟負擔。藥物、手術(shù)是治療眩暈的主要手段，但其均有弊端，如：藥物毒副作用、手術(shù)創(chuàng)傷、費用等，而且有部分患者通過藥物或手術(shù)無法達到治療眩暈的目的，因此，近年提出的促進前庭代償治療模式逐漸成為第三大治療手段，故有必要對前庭代償機制做進一步研究。隨著實驗室技術(shù)的發(fā)展，學者們逐步認識到前庭中樞代償可能與前庭功能障礙恢復密切相關(guān)[3]。

谷氨酸免疫反應物(GLU-IR)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量比較豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，介導興奮性神經(jīng)傳導[4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在大量使前庭神經(jīng)元發(fā)揮正常功能的星形膠質(zhì)細胞(GFAP)，前庭神經(jīng)退變時星形膠質(zhì)細胞反應增強[5]，主要表現(xiàn)為膠質(zhì)細胞肥大及膠質(zhì)細胞增生。星形膠質(zhì)細胞對前庭神經(jīng)元執(zhí)行正常功能所起的作用主要包括：①填充于神經(jīng)元之間起隔離和絕緣作用；②監(jiān)測中樞神經(jīng)細胞間隙；③參與調(diào)節(jié)水和離子的平衡，并參與神經(jīng)元的正常代謝活動；④對多種損傷均出現(xiàn)反應以及屏障作用[6]。γ氨基丁酸B2受體(GABA B2)主要分布在自主神經(jīng)或中樞神經(jīng)突觸末梢，可參與多種神經(jīng)活動；前庭代償涉及到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多個遞質(zhì)的傳導路徑，其中GABA系統(tǒng)與前庭迷路急性損傷后的功能恢復密切相關(guān)[7]。故本研究擬通過制造單側(cè)前庭功能喪失大鼠模型，觀察其前庭內(nèi)側(cè)核及小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2表達的變化，探討前庭中樞代償?shù)目赡軝C制，為今后防治前庭神經(jīng)損傷及促進前庭功能代償提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 45只SPF級SD大鼠雌雄各半，體重200±20 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2010-0001]。動物于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心(室溫20±2 ℃，相對濕度45%)常規(guī)適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為空白對照組(n=9)、生理鹽水注射組(n=18)、模型組(n=18)。

1.2單側(cè)前庭功能喪失大鼠造模 空白對照組不做處理。余兩組大鼠隨機確定實驗耳側(cè)別，生理鹽水注射組于實驗耳鼓室內(nèi)一次性注射生理鹽水0.1～0.2毫升/耳，模型組于實驗耳鼓室內(nèi)一次性注射50%氯仿0.1～0.2毫升/耳[8]；注射后1 h，觀察大鼠行為學特征及失衡行為評分和頭偏斜測量，進行模型評價。造模后，各組大鼠均再常規(guī)飼養(yǎng)3日后進行實驗。

失衡行為評分：一側(cè)迷路破壞后模型組大鼠出現(xiàn)單側(cè)前庭功能喪失的行為學表現(xiàn)特征為自發(fā)眼震、向前庭功能被破壞側(cè)傾倒、頭位向前庭功能破壞側(cè)偏斜及繞圈運動的行為等。參考Petrosini報告的方法[9]，對5個失衡癥狀：頭偏斜，軀干卷曲，肢體外展，強迫環(huán)形運動，頭震(或稱眼震樣頭震)分別進行評分，每個失衡癥狀最嚴重為2分，癥狀消失為0分，總分0～10分。

頭偏斜的測量方法(圖1)：連線1由骶骨中央至第一胸椎中央處，連線2由鼻尖至顱頂正中，測量兩延長線間的夾角即為頭偏斜的度數(shù)[10]。

圖1 模型大鼠頭偏斜度數(shù)測量示意圖

1.3大鼠腦組織取材 造模成功后第3天，進行大腦組織樣本采集，空白對照組隨機抽取3只，余各組大鼠隨機抽取6只，采用過量麻醉法處死，迅速將大鼠置于冰面上，斷頭取腦，完整取下全腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，室溫固定，用于免疫組織化學法檢測各項指標。

空白對照組剩余6只、余各組剩余大鼠12只，同法完整取下全腦，將腦組織置于冰面上，分別分離出實驗耳側(cè)前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球部組織，并用手術(shù)刀將術(shù)側(cè)前庭內(nèi)側(cè)核部、小腦絨球部等分為2份(空白對照組大鼠取雙側(cè)前庭內(nèi)側(cè)核部、小腦絨球部)，一份組織置于2 ml凍存管中，凍存于-80 ℃冰箱中，用于Western-blot法檢測各項指標；另一份組織置于2 ml凍存管中，加入0.5 ml Trizol浸泡，凍存于-80 ℃冰箱中，用于RT-PCR法檢測各項指標。

1.4免疫組化法分別檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達 取出固定好的組織充分沖洗后，將腦干旁內(nèi)側(cè)核部分及小腦絨球部分分別修飾成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的正方形組織塊，全自動脫水機脫水后，浸蠟、包埋，切片，片厚5 μm，烤片2 h。二甲苯及梯度乙醇脫蠟并水化，然后將切片浸泡于預熱的檸檬酸鹽緩沖液中，沸水浴20分鐘，進行抗原修復。將玻片平擺于濕盒中，免疫組化筆圈涂組織薄膜，于圈中央滴加正常山羊血清封閉10 min，傾去封閉液，勿洗。加一抗(1∶300稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日取出，室溫復溫1 h，PBS洗滌，5分鐘/次，5次，于圈中央滴加即用型二抗工作液，37 ℃溫箱中孵育60 min，PBS洗滌，5分鐘/次，5次，甩干玻片上的殘留液體，然后滴加DAB顯色液，溫室避光孵育1～10 min，隨時觀察染色情況。然后自來水輕輕沖洗，終止染色，滴加蘇木素復染30 s～1 min，1%鹽酸乙醇分化10～30 s，自來水沖洗。中性樹膠封片，數(shù)碼顯微鏡下觀察并采集照片，每張切片隨機選取5個視野，采用生物信號采集系統(tǒng)測定平均光密度值，以平均值作為該例樣本目的蛋白相對表達水平。

1.5RT-PCR法檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達 取Trizol液浸泡的前庭內(nèi)側(cè)核組織，于液氮中研磨，將組織研磨成粉末，滴加Trizol液0.5 ml，提取組織中總RNA，測定濃度及質(zhì)量后，采用一步法RT-PCR試劑盒檢測GLU-IR、GFAP、GABA B2 mRNA的表達水平，引物序列詳見表1。經(jīng)ABI Prism 7500 HT序列檢測系統(tǒng)檢測出CT值，運用Livik(2-ΔΔCT)計算相對表達量[11]，并進行統(tǒng)計分析。小腦絨球部位的實驗處理同上。

表1 引物序列表

1.6Western-blot檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達 取凍存的新鮮前庭內(nèi)側(cè)核組織，室溫融化后，稱重，剪碎腦組織，置于2 ml EP管中，按照組織重量(mg)、裂解液(ml)比為100∶1的比例加入含PMSF的組織裂解液，EP管保持在冰面上完成操作。高速電動勻漿機制備組織勻漿，并在冰面上裂解15 min，12 000 g離心力、4 ℃ 離心15 min，分離上清液，即為總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，并調(diào)整蛋白濃度至5 mg/ml，加入6×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5分鐘，進行蛋白變性。以每泳道50 μg的蛋白量進行垂直電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜以5% BSA封閉液溫室封閉1 h，然后將PVDF膜放在抗體孵育盒內(nèi)，加入一抗(稀釋度為1∶300)4 ℃孵育過夜，次日取出復溫1 h，取出殘余抗體，用TBST緩沖液洗膜6次，5分鐘/次。末次洗膜后，用移液器吸干殘余洗膜液，加入HRP標記的二抗(稀釋度為1∶2 000)，37 ℃恒溫水浴振蕩器孵育2 h，去除二抗，洗膜6次后，將PVDF膜甩干水分，放于凝膠成像分析系統(tǒng)中，膜上滴加ECL發(fā)光液，曝光并采集照片，測定目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，并以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平，進行統(tǒng)計分析。小腦絨球部位的實驗處理同上。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料均先進行方差齊性檢驗，然后采用完全隨機設計方差分析(One-way ANOVA法)進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，計量資料以均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1模型評價 模型組大鼠鼓室內(nèi)注射氯仿造成單側(cè)前庭功能破壞后，均出現(xiàn)明確的前庭功能失衡癥狀，空白對照組及生理鹽水注射組無相關(guān)癥狀出現(xiàn)?？瞻讓φ战M失衡癥狀評分及頭偏角度數(shù)與生理鹽水注射組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型組與空白對照組、生理鹽水注射組比較，失衡癥狀評分及頭偏角明顯升高(P<0.01)(表2)，說明模型組造模成功。

表2 各組造模后失衡癥狀評分及頭偏角度數(shù)

2.2免疫組化法檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達 造模成功3天后，生理鹽水注射組前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2表達水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組與生理鹽水注射組、空白對照組比較GLU-IR表達明顯下調(diào)(P<0.05)，GFAP、GABA B2的表達明顯上調(diào)(P<0.05)。模型組前庭內(nèi)側(cè)核GLU-IR、GFAP、GABA B2含量與小腦絨球比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2、表3)。

表3 各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達水平

圖2 各組大鼠腦組織免疫組化染色(DAB顯色×200)

2.3PCR法檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2 mRNA表達 造模成功3天后，生理鹽水注射組前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2表達水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型組與生理鹽水注射組、空白對照組比較GLU-IR表達明顯下調(diào)(P<0.05)，GFAP、GABA B2的表達明顯上調(diào)(P<0.05)。模型組前庭內(nèi)側(cè)核GLU-IR、GFAP、GABA B2表達量與小腦絨球比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 PCR法檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的mRNA表達水平

2.4采用Western-blot檢測各組大鼠GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達 造模成功3天后，生理鹽水注射組前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2表達水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);模型組與生理鹽水注射組、空白對照組比較GLU-IR表達明顯下調(diào)(P<0.05)，GFAP、GABA B2的表達明顯上調(diào)(P<0.05)。模型組前庭內(nèi)側(cè)核GLU-IR、GFAP、GABA B2含量與小腦絨球比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表5、圖3)。

圖3 Western-blot法檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球GLU-IR、GFAP、GABA B2表達水平

表5 Western-blot法檢測各組大鼠前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達

3 討論

單側(cè)前庭功能喪失模型的實驗動物可出現(xiàn)嚴重的姿勢和視動障礙，隨著時間推移，這些癥狀會逐漸好轉(zhuǎn)至消失，這個過程即前庭代償。既然單側(cè)前庭被完全破壞，那么術(shù)側(cè)外周前庭的神經(jīng)輸入即完全消失，這種代償就被認為是中樞前庭系統(tǒng)功能重組的結(jié)果，所以此即中樞代償?shù)膶嶒瀯游锬Ｐ蚚12]。研究已證實前庭代償?shù)倪^程主要由前庭核、前庭核間連合纖維、小腦、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、下橄欖核、舌下神經(jīng)前置核等部位參與，其中以前庭內(nèi)側(cè)核最為重要。同側(cè)前庭核的損傷能阻止單側(cè)迷路破壞后的靜態(tài)代償，因此認為前庭核神經(jīng)元的恢復對行為的恢復起到重要作用[13]。小腦皮層中特別是小腦絨球，對前庭適應亦起作用(Ito,1982)，絨球?qū)ο笮陨窠?jīng)元與前庭內(nèi)側(cè)核(前庭內(nèi)側(cè)核中有15%到20%的神經(jīng)元是對象性神經(jīng)元)，它們接受同側(cè)小腦絨球的單突觸抑制[14]。潘劍等[15]通過將熒光金注射入大鼠絨球進行神經(jīng)元的逆行追蹤，發(fā)現(xiàn)熒光金標記細胞出現(xiàn)在雙側(cè)前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核、脊髓前庭核、腦橋核和下橄欖核等核區(qū)，說明絨球與控制平衡的解剖結(jié)構(gòu)聯(lián)系頗為密切，小腦絨球是前庭眼動反射和平穩(wěn)眼跟蹤運動傳導通路的中心部位，直接或間接地接收大腦視皮質(zhì)、額葉眶區(qū)、顳上回、顳中回、內(nèi)耳半規(guī)管的平衡覺感受器，小腦蚓小結(jié)、腦橋核、下橄欖核等的傳入纖維聯(lián)系[16]。因此，本研究以大鼠前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核及小腦絨球作為實驗部位。

本研究結(jié)果表明，生理鹽水注射組前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR、GFAP、GABA B2表達水平與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義，說明注射生理鹽水未對大鼠前庭功能造成影響。模型組與生理鹽水注射組、空白對照組比較GLU-IR表達明顯下調(diào)，考慮原因可能為GLU-IR介導興奮性神經(jīng)傳導，當術(shù)側(cè)前庭功能喪失后，術(shù)側(cè)前庭神經(jīng)失支配，因而興奮性遞質(zhì)減少。模型組與生理鹽水注射組、空白對照組比較GFAP表達明顯上調(diào)(P<0.05)，考慮原因為前庭功能受損時GFAP反應增強，表現(xiàn)為GFAP表達上調(diào)。模型組與生理鹽水注射組、空白對照組比較GABA B2表達明顯上調(diào)(P<0.05)，考慮原因為GABA B2受體可促進急性期前庭代償?shù)幕謴停瑢Ω纳蒲灠Y狀有積極作用，術(shù)側(cè)前庭功能喪失，大鼠自身的前庭及中樞代償機制使GABA B2表達上調(diào)。模型組前庭內(nèi)側(cè)核與小腦絨球比較GLU-IR、GFAP、GABA B2含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明前庭神經(jīng)核及絨球均為中樞代償?shù)闹匾课弧?/p>

綜上所述，單側(cè)前庭功能喪失可導致前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球中GLU-IR表達下調(diào)，GFAP、GABA B2表達上調(diào)，說明前庭內(nèi)側(cè)核、小腦絨球均參與前庭代償，這可能為前庭代償?shù)臋C制。目前研究表明,修復、適應、習服是前庭受損后代償?shù)娜N方式，臨床上,單側(cè)前庭功能障礙患者常常存在靜態(tài)癥狀和動態(tài)癥狀,其中靜態(tài)癥狀的緩解主要通過靜態(tài)代償,是腦部修復(生化、細胞水平)再平衡結(jié)果[17]。本研究在造模成功后第3天開展研究，目的是研究急性前庭損傷后的靜態(tài)代償期上述指標的變化，未來將深入研究大鼠單側(cè)前庭功能喪失后不同時間上述指標的動態(tài)變化過程，深入探討中樞代償?shù)臋C制，為今后防治前庭神經(jīng)損傷及促進前庭功能代償提供新思路。