糞便脫落細(xì)胞BMP3與BCAT1基因甲基化檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌及癌前病變篩查的價(jià)值

李紅海，張曉鈿，房一鳴，吳俊梅

結(jié)腸癌作為結(jié)腸黏膜上皮惡性腫瘤，侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已至晚期，及早發(fā)現(xiàn)可及早治療，對(duì)于提高生存率及改善預(yù)后具有重要意義[1]。結(jié)腸癌目前的主要檢測(cè)方法為腸鏡檢測(cè)，但為侵入性檢測(cè)，創(chuàng)傷大，且可能造成一些并發(fā)癥[2]，對(duì)患者造成一定的傷害。若能尋找到一種依從性高、診斷價(jià)值高且經(jīng)濟(jì)的非創(chuàng)傷性篩查手段，則可提高結(jié)腸癌甚至癌前病變檢出率，對(duì)于疾病防治有重要意義。糞便樣本取樣簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、有較好的操作性和重復(fù)性，且糞便中含有脫落和游離的癌細(xì)胞DNA，有望成為結(jié)腸癌篩查方法[3]。DNA異常甲基化是腫瘤中常見的表觀遺傳學(xué)改變，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(bone morphogenetic protein 3，BMP3)基因常發(fā)生高頻甲基化，且已成為腫瘤標(biāo)志物用于結(jié)腸癌篩選[4]。甲基化通過多種酶實(shí)現(xiàn)，支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶1(branched-chain amino acid transferase-1，BCAT1)作為啟動(dòng)氨基酸代謝的關(guān)鍵酶，在結(jié)腸癌診斷中亦有一定價(jià)值[5]。但單個(gè)基因診斷價(jià)值有限，目前尚未發(fā)現(xiàn)BMP3、BCAT1及二者聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)腸癌相關(guān)研究，為提高結(jié)腸癌及癌前病變的檢出率，本研究檢測(cè)糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1甲基化情況，為臨床上結(jié)腸癌及癌前病變預(yù)測(cè)提供一定試驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020年2—12月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科患者94例糞便樣本，患者均經(jīng)結(jié)腸鏡檢查或術(shù)后病理切片確診，糞便樣本在腸鏡檢查前或手術(shù)前收集，置于-80℃冰箱保存。其中結(jié)腸癌患者43例(結(jié)腸癌組)、結(jié)腸腺瘤患者19例(結(jié)腸腺瘤組)、單純痔瘡患者32例(對(duì)照組)。結(jié)腸癌組男21例，女22例，年齡45～70(53.78±4.65)歲；心率68～81(76.33±3.17)次/min；呼吸頻率16～20(18.49±1.20)次/min；結(jié)腸腺瘤組男11例，女8例，年齡46～71(54.06±5.81)歲；心率66～80(76.31±3.91)次/min；呼吸頻率15～21(18.43±1.24)次/min。對(duì)照組男17例，女15例，年齡46～70(53.19±4.49)歲；心率67～83(76.49±3.47)次/min，呼吸頻率17～22(18.38±1.18)次/min。3組性別、年齡、心率、呼吸頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=0.453/0.798，F(xiàn)/P=0.227/0.797、0.025/0.975、0.078/0.925)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)審核并通過(審批號(hào)：HYLL-2019-190)，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》要求?；颊呒凹覍僦橥獠⒑炇鹬橥鈺?。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：無家族遺傳史患者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他部位惡性腫瘤者；②樣本采集前進(jìn)行手術(shù)或放、化療患者；③臨床資料不完整者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 臨床/病理特征：收集結(jié)腸癌患者的臨床/病理特征，包括性別、年齡，臨床分期、腫瘤最大徑、腫瘤體積、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度情況等。

1.3.2 BMP3、BCAT1基因甲基化檢測(cè)：自-80℃冰箱中取出糞便，隨機(jī)編號(hào)，每個(gè)樣本稱量200 mg提取脫落細(xì)胞基因組DNA，嚴(yán)格按照磁珠法糞便脫落細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào) WH0114-YNH)說明書進(jìn)行。甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)BMP3、BCAT1甲基化，PCR引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成。首先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s、61℃ 30 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，若擴(kuò)增出大小為142 bp的片段，則DNA提取成功。采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(德國Qiagen公司)修飾DNA，用MSP技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)DNA甲基化情況，BMP3甲基化上游引物：5’-GTTTGGAGTTTAATTTTCGGTTTC-3’，下游引物：5’-ATAACTTCGATCTCTCTCCCTACG-3’(擴(kuò)增長度179 bp，退火溫度54℃)；BMP3非甲基化上游引物：5’-GGTTTGGAGTTTAATTTTTGGTTTT-3’，下游引物：5’-AACTTAATCTCTCTCCCTACACC-3’(擴(kuò)增長度178 bp，退火溫度54℃，位于第3外顯子區(qū))。BCAT1甲基化上游引物：5’-GGTCCCATATTCAACATCTGC-3’，下游引物：5’-CACCTTTCCAGGCTCTTACA-3’(擴(kuò)增長度197 bp，退火溫度58℃)；BCAT1非甲基化上游引物：5’-TATTTGACAAAGAAGAGCTC-3’，下游引物：5’-ACTTGAAAAATCCGGTCCCA-3’(擴(kuò)增長度196 bp，退火溫度60℃，位于第4、5外顯子區(qū))。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)甲基化條帶即為甲基化，僅出現(xiàn)非甲基化條帶即為非甲基化。二者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：只要一個(gè)基因甲基化陽性即判定該樣本陽性。

2 結(jié) 果

2.1 3組患者糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1基因甲基化陽性率比較 糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯(lián)合基因甲基化陽性率比較，結(jié)腸癌組>結(jié)腸腺瘤組>對(duì)照組(P均<0.01)，見表1。BMP3、BCAT1基因甲基化典型瓊脂糖凝膠電泳圖，見圖1。

表1 3組患者糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯(lián)合基因甲基化陽性率比較 [例(%)]

注：S.樣品；M.甲基化；U.非甲基化；Positive.陽性對(duì)照；Negative.陰性對(duì)照；BMP3與BCAT1中S1～S3樣品隨機(jī)選取圖1 3組患者糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1甲基化狀態(tài)

2.2 結(jié)腸癌患者糞便脫落細(xì)胞BMP3與BCAT1聯(lián)合基因甲基化在不同臨床病理特征中比較 糞便脫落細(xì)胞BMP3與BCAT1聯(lián)合基因甲基化與非甲基化結(jié)腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤程度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而甲基化患者腫瘤最大徑、腫瘤體積大于非甲基化患者(P<0.01)，分化程度越低、臨床分期越高基因甲基化陽性率越高，并高于非甲基化患者(P<0.05)，見表2。

表2 結(jié)腸癌患者糞便脫落細(xì)胞BMP3與BCAT1聯(lián)合基因甲基化陽性在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯(lián)合基因甲基化對(duì)結(jié)腸腺瘤的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，BMP3基因甲基化(AUC 0.579，95%CI0.433～0.716)、BCAT1基因甲基化(AUC 0.521，95%CI0.377～0.663)、二者聯(lián)合基因甲基化(AUC 0.574，95%CI0.428～0.711)的AUC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.052，P=0.959)。

2.4 糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯(lián)合基因甲基化對(duì)結(jié)腸癌的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，BMP3基因甲基化(AUC 0.701，95%CI0.585～0.802)、BCAT1基因甲基化(AUC 0.744，95%CI0.630～0.838)、二者聯(lián)合基因甲基化(AUC 0.852，95%CI0.752～0.924)的AUC比較，BMP3與BCAT1聯(lián)合基因甲基化的AUC最高(Z=3.598，P=0.000)，見表3。

表3 糞便脫落細(xì)胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯(lián)合基因甲基化陽性對(duì)結(jié)腸腫瘤的診斷價(jià)值比較

3 討 論

結(jié)腸癌發(fā)病率及病死率在惡性腫瘤中均排名第三位，在過去10年里，盡管對(duì)其診斷和治療取得較大進(jìn)步，但結(jié)腸癌患者5年生存率仍僅為50%～65%[6-7]。結(jié)腸癌的發(fā)病率高，且預(yù)后不良，是世界衛(wèi)生組織公布的公共衛(wèi)生問題[8]，目前亟需解決。尋找能夠及早診斷疾病的基因并予對(duì)應(yīng)治療對(duì)于改善預(yù)后具有較高價(jià)值。本研究中以94例患者糞便樣本為研究對(duì)象，探討單純痔瘡、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌患者糞便脫落細(xì)胞中BMP3、BCAT1基因甲基化情況，為臨床上早期發(fā)現(xiàn)疾病提供一定參考依據(jù)?；蚣谆窃诓桓淖僁NA序列前提下，引起染色體構(gòu)象、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)的相互作用方式發(fā)生改變，從而控制基因表達(dá)，改變表觀遺傳現(xiàn)象[9]。已有研究表明，基因甲基化有望成為早期診斷多種惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物，包括食管癌、肺腺癌以及結(jié)腸癌等[10-12]。

BMP3屬轉(zhuǎn)化生長因子β家族一員，可誘導(dǎo)細(xì)胞分化，促進(jìn)骨、軟骨發(fā)育[13]；在腫瘤中參與腫瘤形成過程，能夠影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤惡性程度和預(yù)后狀況[14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，BMP3甲基化在結(jié)腸癌糞便脫落細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，且對(duì)結(jié)腸癌有一定診斷價(jià)值，已發(fā)現(xiàn)BMP3在結(jié)腸癌中起抑癌作用，抑癌基因失活主要機(jī)制是啟動(dòng)區(qū)甲基化，BMP3的高甲基化對(duì)BMP3的表達(dá)具有抑制作用，可造成基因功能失活，導(dǎo)致腫瘤的形成，對(duì)于篩查結(jié)腸癌具有較大潛力[15-17]。BMP3甲基化升高可能抑制BMP3的表達(dá)，從而使BMP3的抑癌作用降低，間接促進(jìn)癌癥的發(fā)生。BCAT1又名ECA39基因，是催化支鏈氨基酸代謝的一種關(guān)鍵酶，可催化支鏈α-酮酸至支鏈L-氨基酸的可逆轉(zhuǎn)反應(yīng)，從而影響細(xì)胞生長，此外，BCAT1還參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡、分化過程[18-20]；在本研究中尚未發(fā)現(xiàn)單純痔瘡患者中BCAT1甲基化情況，在結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)BCAT1甲基化，且對(duì)結(jié)腸癌有一定診斷價(jià)值。已發(fā)現(xiàn)BCAT1甲基化在結(jié)直腸癌中與癌癥復(fù)發(fā)狀況關(guān)系密切，已成為特定的生物標(biāo)志物[21]。提示BCAT1作為結(jié)腸癌新晉腫瘤標(biāo)志物，若檢測(cè)出現(xiàn)甲基化則患者患結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌的幾率增加。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BMP3、BCAT1二者聯(lián)合基因甲基化對(duì)結(jié)腸癌有較高的診斷價(jià)值?；蚣谆诙鄶?shù)情況下可以調(diào)控遺傳信息的表達(dá)，影響轉(zhuǎn)錄因子與其DNA靶位點(diǎn)的結(jié)合，改變靶基因的表達(dá)，是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素[22-24]。分析結(jié)腸癌患者BMP3、BCAT1二者聯(lián)合基因甲基化與臨床病理資料關(guān)系發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者糞便脫落細(xì)胞BMP3與BCAT1聯(lián)合基因甲基化患者腫瘤最大徑、腫瘤體積大于非甲基化患者，分化程度越低、臨床分期越高甲基化幾率越高，提示BMP3、BCAT1甲基化情況越明顯，腫瘤最大徑越大、腫瘤體積越大、分化程度越低、臨床分期越高，可能促使腫瘤進(jìn)一步惡化，疾病越嚴(yán)重。

綜上所述，結(jié)腸癌中BMP3、BCAT1甲基化程度升高，對(duì)結(jié)腸癌有較高的診斷價(jià)值，且與臨床病理資料關(guān)系密切，在臨床上有一定應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李紅海：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；張曉鈿：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；房一鳴：課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；吳俊梅：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析