外泌體在腦膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展

談胤求綜述 陳謙學(xué)審校

外泌體是直徑在40～120 nm之間的膜性囊泡，可被細(xì)胞攝取及分泌[1]。研究表明，外泌體內(nèi)包含具有生物活性的RNA及蛋白質(zhì)，能夠通過(guò)外泌體進(jìn)行細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物作用[2-4]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，在眾多癌癥中，外泌體內(nèi)特定物質(zhì)(miRNA和/或蛋白)的改變與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[5-8]。文章將對(duì)外泌體的構(gòu)成、起源、功能及其在人腦膠質(zhì)瘤治療中的作用進(jìn)行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的構(gòu)成 在電子顯微鏡下可觀察到外泌體是具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的半球形結(jié)構(gòu)[9]，在外泌體的水囊內(nèi)和膜上包含很多核酸、蛋白質(zhì)，根據(jù)外泌體細(xì)胞來(lái)源的不同，其表面還含有許多不同的受體。外泌體中存在許多類型的蛋白質(zhì)，包括與細(xì)胞間膜融合相關(guān)的膜聯(lián)蛋白和ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白(RAB蛋白)，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白激酶和異源三聚體的G蛋白，有與代謝相關(guān)的酶如過(guò)氧化物酶、脂質(zhì)激酶和烯醇酶-1，還有與抗原提呈相關(guān)的熱休克蛋白HSP70和HSP90[10]。另外四分子交聯(lián)體家族成員也是外泌體中含量豐富的蛋白，包括CD9、CD63、CD81和CD82，它們可與主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子及整合素發(fā)生相互作用[11]。

1.2 外泌體的形成 外泌體的形成主要有2個(gè)步驟，首先是來(lái)源于內(nèi)向萌芽的部分內(nèi)體膜，其包裹著細(xì)胞合成的蛋白與核酸等物質(zhì)，形成管腔囊泡(intraluminal vesicles)，外泌體中也發(fā)現(xiàn)了識(shí)別胞質(zhì)蛋白的抗體，如HSC70[12]。之后，多個(gè)管腔囊泡共同形成多胞體(multivesicular body，MVB)，部分多胞體能夠暴露出胞質(zhì)的轉(zhuǎn)膜蛋白結(jié)構(gòu)域，從而與細(xì)胞質(zhì)膜融合，形成外泌體向胞外釋放，剩下的則被溶酶體降解[13]。

1.3 外泌體的分泌 外泌體通過(guò)晚期內(nèi)吞作用的間室與質(zhì)膜融合的形式分泌到胞外，這種融合是細(xì)胞中最基本、最普遍的形式。而在T細(xì)胞和肥大細(xì)胞中，這種融合則需要依賴鈣離子才能激活[14]。目前對(duì)于這種融合的分子機(jī)制研究甚少，大部分細(xì)胞內(nèi)膜的融合發(fā)生都由特定的蛋白機(jī)制所決定，比如可溶性因素，其中包括N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感的因素(NSF)、可溶性NSF黏附蛋白(SNAP)，以及膜復(fù)合物因素，比如SNAP黏附蛋白受體(SNARE)。發(fā)生融合的2種膜需要具有相應(yīng)的SNARE，即囊泡SNARE(v-SNARE)和目標(biāo)SNARE(t-SNARE)[15-16]。另外外泌體的分泌還受到Rab27a和Rab27b的控制，抑制這兩種Rab27的受體：突觸結(jié)合蛋白樣4(synaptotagmin-like 4)和EXPH5(exophilin 5)能夠抑制外泌體的分泌[17]，但是最近又有研究顯示，敲除PC-3中的Rab27b能夠增加外泌體的釋放[18]。目前還不清楚外泌體分泌的具體調(diào)節(jié)機(jī)制，上述相關(guān)分子在外泌體分泌中發(fā)揮的作用也仍需進(jìn)一步探究。

1.4 外泌體的功能 外泌體可以從不同類型的細(xì)胞中釋放出來(lái)，能夠通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)、蛋白及核酸到接收細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物活性。在免疫應(yīng)答、腫瘤進(jìn)展及神經(jīng)退行性改變等過(guò)程中，外泌體都發(fā)揮著重要作用。在抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，外泌體也參與了MHC的抗原呈遞過(guò)程[19]。在腫瘤進(jìn)展方面，胰腺癌PANC-1細(xì)胞來(lái)源的外泌體不僅能夠分泌Wnt5b，促進(jìn)腫瘤增殖與遷移，而且這種現(xiàn)象還在肺癌及結(jié)腸癌細(xì)胞系中存在[20]。在血管生成方面，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體富含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，可以刺激鄰近腫瘤血管的生成[21]。然而對(duì)于外泌體生物學(xué)功能的具體分子機(jī)制仍不明確，其作用可能受其被分泌和攝取及復(fù)雜的內(nèi)容物等因素影響。

2 外泌體與腦膠質(zhì)瘤

2.1 腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生進(jìn)展 由于外泌體本身包含許多核酸、蛋白，而且可以在細(xì)胞間進(jìn)行交換，因此其可被利用為生物載體，去影響特定的細(xì)胞或分子。在膠質(zhì)瘤中，外泌體也同樣能夠通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)其內(nèi)含物到膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，從而影響膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[22]。膠質(zhì)瘤釋放的外泌體能夠激活糖酵解通路，從而使間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤樣生長(zhǎng)[23]。級(jí)別越高的膠質(zhì)瘤，其釋放的外泌體含量越多[24]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有Notch1蛋白，通過(guò)激活Notch1信號(hào)通路使非干細(xì)胞性膠質(zhì)瘤的干細(xì)胞性和成瘤能力增加[25]。另外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血清循環(huán)外泌體中的miRNA-148a水平更高，抑制miRNA-148a能夠抑制STAT3通路從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[26]。同時(shí)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的含有miRNA-375的外泌體也能夠通過(guò)抑制SLC31A1從而抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展[27]。這些結(jié)果表明，外泌體與膠質(zhì)瘤之間存在非常復(fù)雜的作用關(guān)系，特定來(lái)源的外泌體能夠影響膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

2.2 腦膠質(zhì)瘤的診斷 液體活檢是一種快速、廉價(jià)的獲取腫瘤相關(guān)信息的方法，并且采集方便[28]。利用腫瘤分泌的外泌體可作為功能性生物標(biāo)志物。在臨床實(shí)踐中利用腫瘤來(lái)源的外泌體和相關(guān)核酸及蛋白的分析也有助于以非侵入性的方式建立診斷[29]。理想的生物標(biāo)志物具有為各種臨床應(yīng)用提供重要信息的潛力，如能夠進(jìn)行疾病進(jìn)展的早期檢測(cè)，腫瘤的分子亞型分類及預(yù)測(cè)對(duì)治療可能發(fā)生的反應(yīng)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中鑒定此類生物標(biāo)志物將實(shí)現(xiàn)基于分子水平的檢測(cè)方法，對(duì)患者組織活檢和腫瘤進(jìn)展的MR評(píng)估進(jìn)行補(bǔ)充。MR的特異度范圍在50%～80%之間，通常能區(qū)分膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與其他顱內(nèi)病變，但已被證實(shí)可能錯(cuò)過(guò)早期病變，其分辨率極限為2～3 mm[30-31]。MR在評(píng)估早期腫瘤進(jìn)展中具有顯著的局限性。目前，一些含特定蛋白或RNA的外泌體已被鑒定為神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性生物標(biāo)志物，包括EGFR、IDH1和miRNA-21[32]。miRNA-21是已知的EGFR表達(dá)調(diào)節(jié)因子，所有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腦脊液中均可以檢測(cè)到，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤檢測(cè)的高敏感度標(biāo)志物[33]。除了用于膠質(zhì)瘤的診斷，miRNA-21、miRNA-222及miRNA-124-3p還可以用來(lái)區(qū)分腫瘤假性進(jìn)展和真性復(fù)發(fā)[34]。因此，在血液、腦脊液和其他體液中檢測(cè)特異性腫瘤標(biāo)志物，對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷及腫瘤進(jìn)展的監(jiān)視也具有重要意義[35]。雖然從腦脊液、血液和尿液中提取外泌體非常方便，并且創(chuàng)傷小，但是哪種體液的準(zhǔn)確性更高，或是否需要聯(lián)合使用多種體液進(jìn)行診斷，目前還沒(méi)有定論。

2.3 腦膠質(zhì)瘤治療價(jià)值

2.3.1 腦膠質(zhì)瘤化療：外泌體可以作為腫瘤對(duì)臨床治療敏感性的生物標(biāo)志物。O-6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是一種能夠修復(fù)替莫唑胺處理引起DNA損傷的酶。研究顯示，MGMT的啟動(dòng)子DNA甲基化能夠降低細(xì)胞中特定核蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的療效。22%～57%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者能夠檢測(cè)到MGMT啟動(dòng)子區(qū)的甲基化，而利用免疫磁性外泌體RNA分析患者血清發(fā)現(xiàn)，在表現(xiàn)為耐藥的患者中，經(jīng)過(guò)替莫唑胺治療后外泌體信使RNA表達(dá)水平升高[36-37]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠刺激正常人星形細(xì)胞轉(zhuǎn)變成反應(yīng)性星形細(xì)胞，而反應(yīng)性星形細(xì)胞能夠釋放含有更多MGMT信使RNA的外泌體，這些外泌體被MGMT陰性的膠質(zhì)瘤攝取后便可獲得替莫唑胺抵抗能力[38]。在替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體中，miRNA-2138表達(dá)明顯升高。這種由耐藥膠質(zhì)瘤分泌的含miRNA-2138的外泌體被替莫唑胺敏感的膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取后也能獲得耐藥性[39]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤外泌體的miRNA-221同樣能夠影響腫瘤對(duì)替莫唑胺的敏感性[40]。其他分子的表達(dá)也可以提供標(biāo)志物的間接定量，包括miRNA-603和miRNA-181d，其表達(dá)與MGMT表達(dá)水平直接相關(guān)[37]。因此，可以在治療期間監(jiān)測(cè)以跟蹤了解患者對(duì)治療的反應(yīng)。

2.3.2 膠質(zhì)瘤免疫治療：外泌體可以調(diào)控免疫系統(tǒng)以識(shí)別選定的腫瘤相關(guān)突變或抗原，形成免疫治療方法的基礎(chǔ)，盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以利用血腦屏障部分地逃避免疫應(yīng)答，但免疫療法為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者提供了一種有吸引力的治療方法，因?yàn)樗鼈兺幻庖咭种?，這種方法同時(shí)針對(duì)特定的腫瘤細(xì)胞群，也可以增強(qiáng)其免疫系統(tǒng)。與化學(xué)療法或放射療法不同，免疫療法能夠潛在地靶向腫瘤細(xì)胞，同時(shí)保留非腫瘤細(xì)胞。最早Zitvogel等[41]觀察到在腫瘤多肽存在下孵育的樹突細(xì)胞會(huì)釋放外泌體，刺激細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞并抑制鼠模型中腫瘤生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究揭示樹突細(xì)胞來(lái)源的外泌體(dendritic cell derived exosomes,DCDE)表達(dá)MHCⅠ類和Ⅱ類，其允許外泌體將非自身蛋白的肽片段展示給細(xì)胞毒性T細(xì)胞。DCDE在其脂質(zhì)雙層中也含有CD63，這是一種共刺激蛋白，有助于在抗原呈遞過(guò)程中引導(dǎo)T細(xì)胞[42]。因此，樹突狀細(xì)胞也被用作疫苗，對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行免疫治療[43]。作為細(xì)胞間通信和免疫功能的焦點(diǎn)介質(zhì)，外泌體可以對(duì)包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的免疫細(xì)胞發(fā)揮作用[44]。這為外泌體提供了增強(qiáng)調(diào)理作用，調(diào)節(jié)抗原呈遞，誘導(dǎo)免疫激活和改變免疫抑制的能力[45]。通過(guò)檢測(cè)外泌體中的蛋白及RNA還能反映出膠質(zhì)瘤患者對(duì)于抗腫瘤疫苗使用的效果[46]。而膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自身分泌的外泌體則能夠促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[47]。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)瘤來(lái)源的外泌體在免疫抑制上的能力很有限，僅觀察到了免疫抑制的HLA-DR的單核細(xì)胞表型，但是并沒(méi)能誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活[48]。膠質(zhì)瘤的免疫逃逸可能還涉及其他機(jī)制，但是外泌體在膠質(zhì)瘤免疫治療中的作用正在不斷被挖掘。

2.4 膠質(zhì)瘤預(yù)后評(píng)估 膠質(zhì)瘤的預(yù)后與多種因素相關(guān)，其中包括患者年齡、腫瘤級(jí)別、腫瘤分子病理分型等。而膠質(zhì)瘤外泌體的含量不僅與腫瘤級(jí)別呈正相關(guān)，還與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[24]。同樣的，外泌體中的miRNA不僅可以用來(lái)進(jìn)行診斷和治療，還可以預(yù)測(cè)患者預(yù)后。研究表明，血清外泌體miRNA-301a、miRNA-30a-5p及miRNA-210低水平組的生存率較對(duì)應(yīng)的高水平組更高[49-51]。另外，血清外泌體的miRNA-181b含量越高，患者的術(shù)后存活時(shí)間就越短，并且還提示患者有更差的功能結(jié)果及腫瘤相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生[52]。而利用血清外泌體中的HOTAIR水平也可預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后，并且準(zhǔn)確度和敏感度都較高[53]。通過(guò)生物信息學(xué)分析及臨床標(biāo)本驗(yàn)證也發(fā)現(xiàn)，血清外泌體的miRNA-210、miRNA-449及miRNA-5194均與膠質(zhì)瘤的級(jí)別、診斷、侵襲及預(yù)后相關(guān)。未來(lái)通過(guò)更加深入地對(duì)外泌體的研究可能發(fā)現(xiàn)更多針對(duì)膠質(zhì)瘤預(yù)后的敏感度和特異度都極高的分子。

3 小結(jié)與展望

已知外泌體與其他細(xì)胞外囊泡一起作用于供體和受體細(xì)胞的長(zhǎng)距離通信，以遞送許多分子和分子信息。研究表明，外泌體可參與許多基于腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的調(diào)節(jié)，并且影響腫瘤對(duì)免疫和藥物的反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體不僅可以促進(jìn)腫瘤自身的生長(zhǎng)，還能夠通過(guò)影響瘤周微環(huán)境促使正常細(xì)胞向有利于腫瘤生長(zhǎng)的方面改變，如內(nèi)皮細(xì)胞血管生成增加等。通過(guò)檢測(cè)、調(diào)控膠質(zhì)瘤來(lái)源的外泌體可能會(huì)給膠質(zhì)瘤的診斷和治療帶來(lái)突破性進(jìn)展。然而外泌體領(lǐng)域的研究尚不深入，特別是在膠質(zhì)瘤方面的研究還處于起步階段。未來(lái)更全面地了解外泌體將會(huì)給膠質(zhì)瘤乃至其他腫瘤的治療帶來(lái)新的希望。