HPLC-QAMS 法同時測定芪冬頤心顆粒中7 種成分的含量*

劉 華，喬春鳳，陳海燕

1 鄭州頤和醫(yī)院 藥學(xué)部，鄭州 450047；2 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，南寧 530023

芪冬頤心顆粒由黃芪、麥冬、茯苓、人參、地黃、燙龜板、淫羊藿、煅紫石英、桂枝、金銀花、丹參、郁金和炒枳殼等13 味中藥材加工而成，現(xiàn)收載于《中國藥典（2015 年版一部）》，主要用于氣陰兩虛所致的心悸、胸悶、胸痛、氣短乏力、失眠多夢、自汗、盜汗、心煩等癥候的治療，亦可用于病毒性心肌炎、冠心病心絞痛見上述癥候的治療[1]。中成藥復(fù)方制劑是多成分的集合體，通過多個成分間相互協(xié)同作用達(dá)到臨床的治療效果，近年來，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式已逐步應(yīng)用于中藥及其制劑中。芪冬頤心顆?，F(xiàn)行單成分質(zhì)量控制方法[1]難以全面評價其產(chǎn)品質(zhì)量，尚未見對芪冬頤心顆粒所含成分進(jìn)行定量研究的文獻(xiàn)報道，因此選取淫羊藿苷為內(nèi)參物，采用高效液相色譜一測多評法對芪冬頤心顆粒中主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸和茯苓酸的含量進(jìn)行同時測定，建立芪冬頤心顆粒多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，為全面有效地控制產(chǎn)品整體質(zhì)量提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與藥品

Agilent 1290 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XP105 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

芪冬頤心顆粒（規(guī)格：每袋裝5 g，批號：190201、190302、190304）來源于沈陽東新藥業(yè)有限公司；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：111920-201606，純度：97.6%）和寶藿苷I 對照品（批號：111852-201603，純度：99.9%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；芒柄花素對照品（批號：PRF8091225，純度：99.9%）來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；去氫土莫酸對照品（批號：CFS201802，含量：98.0%）來源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；朝藿定A 對照品（批號：18050224，純度：96.5%）、淫羊藿苷對照品（批號：18052121，純度：98.2%）、茯苓酸對照品（批號：18053121，純度：99.5%）均來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品貯備液和混合對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸和茯苓酸對照品適量，用甲醇制成濃度分別為0.316、0.718、0.454、0.982、0.596、0.118、0.172 mg·mL-1的混合對照品貯備液。精密吸取混合對照品貯備液2.5 mL，用甲醇定容至50 mL，制成濃度分別為15.8、35.9、22.7、49.1、29.8、5.9、8.6 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液和陰性供試品溶液的制備

取芪冬頤心顆粒適量，混勻研細(xì)，取粉末1.0 g，精密稱定，加入25 mL 甲醇，稱重，超聲提取30 min，放冷后稱重，用甲醇補重后過濾，制成芪冬頤心顆粒供試品溶液。按照《中國藥典（2015 年版一部）》芪冬頤心顆?！百|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”項下的處方工藝，分別制備缺黃芪、缺淫羊藿或缺茯苓的陰性樣品，再按上述方法制備成3 種陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm（0～25.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素）[2]、270 nm（25.0～42.0 min 檢測朝藿定A、淫羊藿苷和寶藿苷I）[3，4]和210 nm（42.0～60.0 min 檢測去氫土莫酸和茯苓酸）[5，6]；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～14.0 min，16.0%A；14.0～25.0 min，16.0%A→24.0%A；25.0～42.0 min，24.0%A→45.0%A；42.0～54.0 min，45.0%A →82.0%A；54.0～60.0 min，82.0%A→16.0%A）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 專屬性試驗

精密吸取“2.1”項下制備的混合對照品溶液和“2.2”項下各溶液依法進(jìn)樣測定，結(jié)果在供試品溶液色譜圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸和茯苓酸峰形對稱，與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按各目標(biāo)成分色譜峰計均≥4000，上述成分的含量測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）、芪冬頤心顆粒（B）、黃芪陰性樣品（C）、淫羊藿陰性樣品（D）和茯苓陰性樣品（E）的HPLC 色譜圖譜

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精密吸取 “2.1” 項下混合對照品貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別用甲醇定容至20 mL，制成線性考察混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，以質(zhì)量濃度（c，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7 種成分的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.6 進(jìn)樣精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

取“2.1”項下混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，測得7 種成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 分別為1.02%、0.62%、0.85%、0.59%、0.68%、1.23%、1.11%。

取同一批號芪冬頤心顆粒適量（批號：190201），按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測定各成分的峰面積，測得7 種成分含量的RSD 分別為1.65%、1.16%、1.29%、0.97%、1.02%、1.81%、1.78%。

取芪冬頤心顆粒（批號：190201）的同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、18 h 進(jìn)樣，檢測7 種成分的峰面積，結(jié)果芪冬頤心顆粒供試品溶液18 h 內(nèi)穩(wěn)定，7 種成分峰面積的RSD 分別為0.99%、0.64%、0.86%、0.57%、0.71%、1.19%、1.08%。

2.7 回收率試驗

取7 種成分含量已知的同一批次芪冬頤心顆粒（批號：190201）適量，除去內(nèi)包裝，混勻研細(xì)，每份0.5g，取9 份，精密稱定，隨機分成3 組，每組3 份，按《中國藥典（2015 年版四部）》要求，精密加入混合對照品溶液（毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.113mg·mL-1、芒柄花素0.241mg·mL-1、朝藿定A0.169mg·mL-1、淫羊藿苷0.354mg·mL-1、寶藿苷I0.213mg·mL-1、去氫土莫酸0.041 mg·mL-1、茯苓酸0.059mg·mL-1）1.0、2.0、3.0mL 各一組，使各成分對照品加入量約為樣品含有量的50%、100%、150%，再按照“2.2”項下方法制備加樣供試品溶液，依法進(jìn)樣測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，采用外標(biāo)法計算7 種成分的加樣回收率，其平均加樣回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為97.44%（0.93%）、99.60%（0.86%）、99.21%（1.36%）、100.03%（0.75% ）、98.77%（1.08%）、97.64%（1.22%）、96.86%（1.07%）。

2.8 相對校正因子（RCF）的測定

依據(jù)“2.5”項下6 種線性關(guān)系（見表1），精密吸取混合對照品溶液適量，依法進(jìn)樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，以淫羊藿苷為內(nèi)參物，按照計算公式：RCF=fS/fR=

（式中c 代表質(zhì)量濃度，A 代表峰面積，S 代表內(nèi)參物，R代表其他待測組分）分別計算6 種成分的RCF，結(jié)果見表2。

表2 6 種成分的相對校正因子

2.9 RCF 耐用性考察

精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，分別考察高效液相色譜儀（Agilent 1290 型、Waters e2695 型）、色譜柱（Agilent TC-C18柱、Phenomenex C18柱、Waters XTerra MS C18柱）、柱溫（28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃）和流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1）對RCF 的影響。結(jié)果顯示在不同儀器、色譜柱條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的平均對相對校正因子分別為1.3037、0.9395、1.6854、1.0760、2.0079、1.5491，RSD 分別為0.48%、0.69%、1.03%、0.86%、0.49%、0.67%；不同柱溫條件下，各成分的平均相對校正因子分別為1.3039、0.9453、1.6918、1.0764、2.0154、1.5515，RSD 分別為0.46%、0.95%、1.19%、1.39%、0.32%、0.63%；不同流速條件下，各成分的平均相對校正因子分別為1.3019、0.9409、1.6878、1.0726、2.0161、1.5469，RSD 分別為0.35%、0.82%、1.01%、1.34%、0.49%、0.83%。結(jié)果表明，所建立的RCF 耐用性良好。

2.10 待測組分色譜峰的定位

精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸色譜峰的保留時間，以內(nèi)參物淫羊藿苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，在不同品牌高效液相色譜儀（Agilent 1290 型、Waters e2695 型）和不同品牌色譜柱（Agilent TC-C18柱、Phenomenex C18柱、Waters XTerra MS C18柱）條件下，采用相對保留時間值法對色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的平均相對保留時間分別為0.5118、0.6468、0.9270、1.1335、1.4188、1.5605，RSD分別為1.51%、0.98%、0.69%、0.80%、0.36%、0.83%。

2.11 樣品含量測定

取3 個不同批號的芪冬頤心顆粒，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每個批號平行3 份，依法進(jìn)樣測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，采用外標(biāo)法和一測多評法分別計算上述7 種成分的含量。見表3。

表3 7 種成分含量測定結(jié)果（mg·g-1，n=3）

3 討論

3.1 流動相的篩選

本實驗在芪冬頤心顆粒中測定目標(biāo)7 種成分的色譜峰的峰形及分離效果，同時兼顧雜質(zhì)成分的干擾情況，參考相關(guān)文獻(xiàn)，依次對比考察了乙腈-水[3，4]、乙腈-0.1%磷酸水溶液[5，6]、乙腈-0.1%甲酸水溶液[2]流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)目標(biāo)成分分離效果較好，色譜圖基線較為平穩(wěn)且雜質(zhì)干擾較小，通過對流動相比例不斷摸索優(yōu)化，最終確定采用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。按照“2.3” 項下流動相比例梯度洗脫可用于芪冬頤心顆粒中7 種成分含量的同時測定。

3.2 供試品制備方法的確定

本實驗在芪冬頤心顆粒中測定目標(biāo)7 種成分綜合提取率，同時兼顧分析檢測時間及雜質(zhì)干擾程度，依次對比考察了提取溶劑（甲醇[5，6]、稀乙醇[3，4]）和提取方式（超聲提取[5，6]、加熱回流提取），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇超聲提取效果最佳，還對提取時間進(jìn)行摸索優(yōu)化，最終確定采用甲醇超聲提取30 min 制備芪冬頤心顆粒供試品溶液。在此條件下，7 種成分能夠提取完全，在60 min內(nèi)能夠完成7 種成分的檢測，雜質(zhì)干擾較小。

4 小 結(jié)

本實驗運用HPLC-QAMS 法對芪冬頤心顆粒中7 種成分含量進(jìn)行了同時測定，建立其多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式。與外標(biāo)法比較，各成分含量測定結(jié)果無顯著差異（見表3）。本方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，為全面評價芪冬頤心顆粒整體內(nèi)在質(zhì)量、提升該顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)，以確保臨床用藥的穩(wěn)定性和治療效果的一致性。