云南藍(lán)莓根癌病病原鑒定及其防控藥劑的篩選

張榮琴，萬效琰，張晉豪，代真林，鄭建立，崔興國，趙項(xiàng)武，魏蘭芳，姬廣海

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南河口 661300；3曲靖佳沃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，云南曲靖 655000）

0 引言

藍(lán)莓(Vaccinium spp.)又稱越桔，屬杜鵑花科越桔屬灌木，分布在熱帶、亞熱帶、溫帶等地區(qū)。藍(lán)莓果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的栽培前景[1]。近年來，藍(lán)莓在云南省的種植面積逐年增加，各種藍(lán)莓病害也頻繁發(fā)生[2]，其中藍(lán)莓根癌病是一種為害藍(lán)莓根部的重要病害，使藍(lán)莓產(chǎn)量急劇下降，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。根癌病是一種普遍發(fā)生的細(xì)菌性病害，由具有致瘤性的根瘤菌科菌株引起，包括土壤桿菌屬、異根瘤菌屬和根瘤菌屬的多個(gè)種，可侵染多種果樹和一些多年生觀賞植物[3]，危害根頸、主根、側(cè)根[4]，為果園及苗圃帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。2010年，阿根廷首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了由根癌農(nóng)桿菌引起的藍(lán)莓根癌病[5]，同年國內(nèi)研究人員在遼寧、吉林、山東及黑龍江省發(fā)現(xiàn)了藍(lán)莓根癌病[6]，目前未見云南省藍(lán)莓根癌病的研究報(bào)道。為闡明云南省發(fā)生的藍(lán)莓根癌病病原菌種類，筆者采用多點(diǎn)采樣，進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)、致病性測定和病原菌的系統(tǒng)鑒定，以期為藍(lán)莓根癌病的研究和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

藍(lán)莓根癌病樣品分別采集自云南省藍(lán)莓主栽區(qū)曲靖市麒麟?yún)^(qū)、馬龍區(qū)，玉溪市澄江縣，昆明市石林縣藍(lán)莓基地發(fā)病地塊。采集具有根癌病病癥的根部腫瘤組織，保存于紙質(zhì)采樣袋中。

1.2 菌株分離和培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[7-8]中根癌菌的分離方法。選取根部腫瘤組織白色幼嫩部分，清洗干凈后用75%乙醇表面消毒60 s，再用無菌水漂洗3次，用無菌研缽將組織研碎，轉(zhuǎn)移至無菌三角瓶中，加入45 mL無菌水，28℃160 r/min振蕩30 min，將上清液梯度稀釋(10-1～10-5)，各取100 μL在YEM和MW培養(yǎng)基按低濃度至高濃度進(jìn)行涂布分離，28℃培養(yǎng)48 h。參考文獻(xiàn)[9]中根癌土壤桿菌代表菌株的菌落特征和生物學(xué)特性測定方法，篩選具有根癌土壤桿菌特征的單菌落，純化培養(yǎng)2代后保存?zhèn)溆茫ū?）。

表1 藍(lán)莓根部腫瘤中分離獲得的菌株

1.3 致病性測定

1.3.1 向日葵、番茄接種試驗(yàn) 選取向日葵和番茄為指示植物[10]。將分離得到的20株純培養(yǎng)菌株（表1）分別接種到50 mL KB液體培養(yǎng)基中，28℃過夜培養(yǎng)，制備濃度為1×109CFU/mL的菌懸液。采用針刺法接種健康向日葵和番茄植株的莖基部并用脫脂棉保濕，對照用無菌水接種處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。每天觀察植株發(fā)病情況，2周后開始觀察并記錄腫瘤的生長情況。根據(jù)柯赫氏法則對發(fā)病部位進(jìn)行再分離，根據(jù)菌株的形態(tài)特征判斷分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

1.3.2 藍(lán)莓回接試驗(yàn) 選取致病性較強(qiáng)的菌株回接藍(lán)莓。菌懸液制備方法同1.3.1，灌根生長健壯的藍(lán)莓植株，對照用無菌水灌根處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。每天觀察植株發(fā)病情況，30天后開始觀察記錄腫瘤的生長情況。

1.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 病原菌DNA的提取 將供試菌株L-11、2JK11（芽孢桿菌）、1-BT-186（假單胞菌）、1-BT-22（冬青節(jié)桿菌）、2-BT-19（黃桿菌）、RG-4（根瘤菌）接種至NA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取少量菌體接種于LB液體培養(yǎng)基，28℃160 r/min過夜培養(yǎng)后收集菌體。按照細(xì)菌DNA提取試劑盒（天根DP302-02）說明書提取細(xì)菌基因組DNA。

1.4.2 16S rDNA序列分析及其同源性比較 根據(jù)已發(fā)表的細(xì)菌16S rDNA通用引物[11]27F和1492R對供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’)/1492R(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。 參 照 Taq PCR Master Mix（catTSE030，擎科）配制25 μL PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將得到的16S rDNA序列與BLAST中的分析結(jié)果進(jìn)行比較，使用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4.3 特異性引物設(shè)計(jì)及檢測 將根癌土壤桿菌的ipt基因在BLAST中進(jìn)行同源性比對并將靶片段序列通過BLASTn進(jìn)行同源性比對，設(shè)計(jì)出特異性較強(qiáng)的藍(lán)莓根癌病菌特異性引物[12-14]，由昆明擎科生物技術(shù)公司合成。引物序列為AtP3F(5’-GCAACGAGTTAGCAGAC GAG-3’)/AtP3R(5’-CCCATCGATCCCTTCCAGTA-3’)，預(yù)期片段為155bp。

利用AtP3F/AtP3R對菌株L-11和5株非靶標(biāo)菌株2JK11、1-BT-186、1-BT-22、2-BT-19、RG-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參照Taq PCR Master Mix（catTSE030，擎科）配制25 μL PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增程序同1.4.2，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.5 Biolog生理生化特性測定

采用美國BIOLOG公司的MicrostationTMV 4.01系統(tǒng)、革蘭氏陰性菌微板(GN)和數(shù)據(jù)庫，Biolog-GN板反應(yīng)底物如表2，試驗(yàn)程序按公司的操作指南進(jìn)行。將供試菌株L-11在YEM培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接2次，劃線接種到Bug瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽輕輕擦拭培養(yǎng)基上的菌落，移入無菌稀釋緩沖液中，混勻得到菌懸液，測定其濁度為98%。用移液器將菌懸液加入GN微孔板，每孔150 μL，共96孔，對照孔加150 μL無菌水，置于28℃培養(yǎng)，4、24、48 h后讀數(shù)記錄結(jié)果。

表2 Biolog GN微孔板上96種碳氮源底物

1.6 田間藥劑篩選

1.6.1 供試藍(lán)莓 試驗(yàn)藍(lán)莓園位于曲靖市麒麟?yún)^(qū)越州鎮(zhèn)大梨樹村，試驗(yàn)于2018年12月開始、2019年5月結(jié)束。

1.6.2 供試藥劑 化學(xué)藥劑包括50%氯溴異氰尿酸粉劑（南京南農(nóng)農(nóng)藥科技發(fā)展有限公司），1.5%噻霉酮水乳劑（陜西西大華特科技實(shí)業(yè)有限公司），1%申嗪霉素懸浮劑（上海農(nóng)樂生物制品有限公司），葉斑寧-60億芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌Lx-11水劑（江蘇蘇科農(nóng)化有限公司）。生防菌劑為WR13-6、C3、13-6、枯草芽孢桿菌，均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.6.3 試驗(yàn)方法

（1）藥劑施用方法。選擇基地中發(fā)病嚴(yán)重的藍(lán)莓植株進(jìn)行藥劑試驗(yàn)，共9個(gè)處理（8個(gè)藥劑處理，1個(gè)空白處理），每個(gè)處理30株藍(lán)莓，供試藥劑稀釋至相應(yīng)濃度（表3），每隔10天灌根1次，每株每次灌1000 mL，共灌根5次。

表3 藥劑施用濃度

（2）試驗(yàn)結(jié)果調(diào)查及統(tǒng)計(jì)方法。

①坐果率調(diào)查。花期結(jié)束后每隔15天調(diào)查1次坐果情況，直至果實(shí)子房膨大成形不再出現(xiàn)生理落果為止。

②田間藥劑防效評估。最后一次灌根10天后進(jìn)行病情調(diào)查。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5株藍(lán)莓進(jìn)行調(diào)查，3次生物學(xué)重復(fù)，依據(jù)根瘤情況進(jìn)行分級（表4），按照式(2)～(4)計(jì)算各處理的發(fā)病率、病情指數(shù)以及防效。

表4 根癌病分級標(biāo)準(zhǔn)

式中，A為試驗(yàn)區(qū)處理后的病情指數(shù)，B為試驗(yàn)區(qū)處理前的病情指數(shù)，C為對照區(qū)處理后的病情指數(shù)，D為對照區(qū)處理前的病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

藍(lán)莓根部腫瘤早期呈圓形、黃白色，后期瘤體慢慢變大，并由黃褐色變?yōu)榘岛稚?。根部腫瘤傾向于木質(zhì)化，表皮粗糙，近圓形或不規(guī)則，直徑可達(dá)2～3 cm，嚴(yán)重可達(dá)10～15 cm。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根癌發(fā)病早期在苗木根部形成較小的白色或者肉色粗糙瘤狀物（圖1D）。感染根癌病后，植物根部吸收水分及營養(yǎng)物質(zhì)受阻，根系發(fā)育不良；發(fā)病后期，植株生長緩慢，葉片變黃、干枯甚至整株死亡[12]。

圖1 田間藍(lán)莓發(fā)病癥狀

2.2 致病性測定

2.2.1 向日葵、番茄接種試驗(yàn) 20株供試菌株接種向日葵幼苗2周后，接種P2-2、L-3、L-11、L-5的向日葵在莖基部開始出現(xiàn)不規(guī)則的瘤狀突起，接種其他菌株的向日葵和對照無瘤狀突起（圖2A）；接種30天后，瘤狀突起逐漸增大形成明顯腫瘤，接種L-11的植株瘤狀突起最大，其余16株菌株和對照仍無瘤狀突起。L-11接種番茄幼苗14天后，接種部位出現(xiàn)瘤狀突起（圖2B）。從接種發(fā)病部位重新分離病原菌獲得純培養(yǎng)物，通過菌株形態(tài)學(xué)特征判斷分離得到的病菌與原接種菌株相同。

圖2 L-11致病性檢測

2.2.2 藍(lán)莓植株回接試驗(yàn) L-11灌根藍(lán)莓60天后，在接種植株根部形成不規(guī)則的結(jié)節(jié)狀突起，對照植株的接種部位無瘤狀突起。90天后瘤狀突起逐漸增大，形成明顯的冠癭瘤（圖3B），對照植株無腫瘤形成（圖3A）。

圖3 L-11接種藍(lán)莓幼苗的癥狀

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 Biolog生理生化鑒定 將L-11菌懸液接種到Biolog革蘭氏陰性菌微孔板(GN)中，4、24、48 h后分別測定其對碳、氮源的利用情況并與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比較。L-11與數(shù)據(jù)庫中的放射根瘤菌/土壤桿菌屬(Rhizobium radiobacter/Agrobacetrum sp.)相似程度較高（表5），碳源、氮源利用情況完全相同，均不能利用亞甲基丁二酸(E2)、α-氧代戊酸(E5)、D-絲氨酸(G8)。

表5 L-11菌株在Biolog GN微板中的代謝活性195 mm×132 mm(96×96 dpi)

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

（1）16S rDNA分子鑒定。以L-11基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物約1500 bp。L-11 16S rDNA測序序列（登錄號MK910214.1）進(jìn)行BLAST比對,與根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens Ell-7序列（登錄號FJ613554.1）相似度達(dá)到97.65%；將L-11的16S rDNA序列與其他農(nóng)桿菌屬的序列進(jìn)行比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），表明L-11與標(biāo)準(zhǔn)菌株Ell-7親緣關(guān)系最近。因此，云南省藍(lán)莓根癌病的病原菌鑒定為根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。

圖4 基于16S rDNA序列的藍(lán)莓根癌病原菌相關(guān)種系統(tǒng)發(fā)育樹

（2）特異性引物擴(kuò)增結(jié)果（圖5）。利用根癌土壤桿菌特異性引物AtP3F/AtP3R，對L-11、2JK11、1-BT-186、1-BT-22、2-BT-19、RG-4基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。L-11擴(kuò)增出155 bp的特異性片段，其他菌株均未擴(kuò)增出條帶，可將L-11鑒定為根癌土壤桿菌。

圖5 特異性引物AtP3F/AtP3R擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜

2.4 田間藥劑篩選

藥劑篩選結(jié)果（表6）表明，1.5%噻霉酮水乳劑防治效果最好(52%)，1%申嗪霉素懸浮劑、C3生防菌劑、50%氯溴異氰尿酸粉劑防治效果次之，分別為48%、45%、43%。

表6 藍(lán)莓根癌病田間藥劑試驗(yàn)防治結(jié)果

3 結(jié)論

本研究對云南省藍(lán)莓主產(chǎn)區(qū)采集的藍(lán)莓根癌病樣品進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，通過致病性測定和多種分類鑒定方法，證實(shí)云南發(fā)生的藍(lán)莓根癌病是由根癌土壤桿菌所致，并篩選出對藍(lán)莓根癌病有較好防治效果的藥劑1.5%噻霉酮水乳劑，為進(jìn)一步開展有關(guān)該病發(fā)病規(guī)律及防治技術(shù)的系統(tǒng)研究提供科學(xué)依據(jù)。

4 討論

根癌病菌可侵染93科331屬643種植物，包括多種果樹、林木、花卉甚至瓜類，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[15]。根癌病病原菌較多，包括土壤桿菌屬、異根瘤菌屬和根瘤菌屬的多個(gè)種[2]。土壤桿菌屬和根瘤菌屬的關(guān)系一直存在爭議。有學(xué)者提出按照16S rDNA序列分析可將土壤桿菌屬(Agrobacterium)和異根瘤菌屬(Allorhizobium)歸為根瘤菌屬(Rhizobium)[16]，但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)根瘤菌屬(Rhizobium)中個(gè)別種與土壤桿菌屬的關(guān)系不是很密切，不能籠統(tǒng)地說土壤桿菌和根瘤菌的關(guān)系較近，而應(yīng)該深入研究土壤桿菌與根瘤菌的種間關(guān)系[17]。土壤桿菌屬與根瘤菌屬的鑒別標(biāo)準(zhǔn)之一是病菌引起致病癥狀還是引起根瘤[18]。本研究分離得到的菌株P(guān)2-2、L-3、L-11、L-5都會引起藍(lán)莓根部腫瘤，說明這4株菌歸類至土壤桿菌屬。

根癌病菌通過傷口侵染植物，T-DNA在寄主植物中表達(dá)，編碼生長素和細(xì)胞分裂素的生物合成，使植物細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤的形成[19]?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治效果并不顯著，持效性差[20]，1.5%噻霉酮水乳劑防治效果較好但相對防效也僅為52%。目前生物防治研究發(fā)展較快，R.rhizogenes K84（商品名根癌寧）可有效防治桃根癌病[21]。K84是Kerr于1972年發(fā)現(xiàn)的一株無致瘤性的發(fā)根根瘤菌[22]，主要作用方式是接合質(zhì)粒pAgK84編碼產(chǎn)生土壤桿菌素84進(jìn)而殺滅細(xì)菌[23]。另外放射土壤桿菌M I-15也能有效抑制葡萄根癌菌的生長和致瘤[24]。還有無致病性的葡萄土壤桿菌E26菌株對葡萄根癌病具有良好防效[25]。目前生產(chǎn)上可在施用藥劑的同時(shí)，采用植物檢疫，苗木、砧木消毒，及時(shí)清除田間病株，選育抗病品種，改進(jìn)嫁接方式等手段進(jìn)行綜合治理，控制藍(lán)莓根癌病的發(fā)生，以實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。