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    基于高通量測序方法的蒙古櫟SSR標記開發(fā)

    2021-07-12 02:26:44于世河姜義仁卜鵬圖
    中國農(nóng)學通報 2021年16期
    關鍵詞:基元蒙古多態(tài)性

    陳 罡,于世河,姜義仁,卜鵬圖,鄭 穎,馮 健

    (1遼寧省林業(yè)科學研究院,沈陽 110032;2沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院,沈陽 110866)

    0 引言

    蒙古櫟(Quercus mongolica)為殼斗科櫟屬植物,主要分布于中國的華北、東北,朝鮮半島,俄羅斯遠東和蒙古等地。蒙古櫟是國內東北和華北地區(qū)針闊葉混交林的主要建群種,在維持地域生態(tài)平衡和生態(tài)系統(tǒng)恢復重建中有重要的作用,因此具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值[1]。有關蒙古櫟種內遺傳變異的研究相對較少[2],為育種、造林和基因資源保存,有必要對現(xiàn)有的蒙古櫟天然林、天然次生林進行分子水平的遺傳多樣性研究[3]。

    SSR標記是一種比較理想的共顯性分子標記,具有基因組中廣泛存在、特異性強、多態(tài)性高、實驗重復性好、結果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點,被廣泛應用于林木遺傳改良、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種、遺傳多樣性研究、親緣關系分析、種質資源保存、QTL作圖等許多應用研究領域[4]。目前,對部分地區(qū)的蒙古櫟群體遺傳多樣性研究大都利用RAPD標記、等位酶技術、AFLP技術及ISSR標記等顯性分子標記技術[5-8],可供利用的專門針對蒙古櫟開發(fā)的SSR標記較少[9-11],因此需要更多的SSR標記的開發(fā)進行補充,以增加位點數(shù)[12]。目前尚未見到利用二代基因組測序技術開發(fā)蒙古櫟SSR位點的報道。本研究基于中國分布蒙古櫟基因組de novo拼接的二代測序數(shù)據(jù),旨在發(fā)掘一批擴增效率高、多態(tài)性好的引物,為進一步開展蒙古櫟遺傳資源評價、種質資源多樣性分析提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    2018年6月下旬采集遼寧8個不同地區(qū)的蒙古櫟葉片,硅膠干燥保存?zhèn)溆谩S糜诙鷾y序建庫的樣本群體為DA(采自撫順大孤家),用于引物驗證的8個樣本信息見表1。

    表1 樣本采樣信息

    1.2 基因組DNA提取與建庫測序

    采用CTAB法提取基因組DNA[13],用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA大小和完整性。利用NanoDrop ND-2000分光光度計(Thermo Fish Scientific公司)分析DNA純度和濃度,隨后用1×TE緩沖液稀釋基因組DNA至終濃度為20 ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    DNA打斷,末端補平,3'端加A,連接測序接頭,文庫構建并質檢,構建合格的文庫利用Illumina HiSeq2500平臺進行雙末端測序。實驗由北京閱微基因技術有限公司完成。

    1.3 生物信息學分析

    原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式進行保存,用Trimmomatic軟件[14]進行數(shù)據(jù)過濾,去除reads中包含的測序接頭序列、低質量序列、重復reads、含N(N表示無法確定堿基信息)的序列,最后得到干凈序列(clean reads)。用Flash軟件進行無參考基因組的de novo拼接[15],默認參數(shù)設置。

    1.4 基因組SSR位點開發(fā)與引物設計

    利用MISA軟件[16]對拼接好的序列片段進行SSR位點搜索和鑒定,MISA軟件能識別出序列中的單核苷酸SSR和復合SSR及所在的位點,查找參數(shù)設為二、三、四、五核苷酸最小重復次數(shù)為6、5、5、5次。用Primer3對含有SSR位點且側翼適合設計引物的序列進行引物設計。將設計的引物與前人已開發(fā)的SSR引物進行比對,去除重復位點。

    1.5 引物篩選與PCR擴增

    PCR 反應體系為 10 μL:10×Buffer I 1.0 μL,2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL,帶有M13序列的熒光引物TP-M13(5 μmol/L)0.5 μL(HEX 或 FAM 熒光),特異SSR 引 物 (5 μmol/L)0.6 μL,Takara HS Taq( 大 連TaKaRa生物)0.1 μL,DNA模板1.2 μL,ddH2O 5.8 μL。

    按以下程序在GeneAmp 9700上(Applied Biosystems公司)完成PCR擴增。95℃在PCR儀上進行預熱5 min;然后94℃模板變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,程序重復30次循環(huán);隨后94℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸擴增30 s,重復10個循環(huán);最后60℃持續(xù)30 min。向96孔板中每孔加入分子量內標GS500 LIZ(Applied Biosystems公司)和甲酰胺混合液(0.5:8.5)9 μL,PCR產(chǎn)物1.0 μL,95℃變性3 min。帶有不同熒光PCR擴增產(chǎn)物上ABI 3730XL測序儀進行檢測。將檢測得到的原始數(shù)據(jù)“.fsa”文件導入到分析軟件GeneMapper 3.2(Applied Biosystems公司)中進行自動分析,手工校正。多色熒光引物合成和檢測均由北京閱微基因技術有限公司完成。用Popgene32軟件計算遺傳距離(Nei)[17]。

    2 結果與分析

    2.1 蒙古櫟SSR位點開發(fā)

    共測得2.6 G的數(shù)據(jù)量,獲得原始reads 8956795對,用Flash軟件拼接后獲得4876401條序列。MISA軟件對拼接后的序列進行掃描,搜索鑒定SSR位點,共在282605條序列鑒定出SSR基元,占拼接序列總數(shù)的5.8%。選擇含有SSR位點的序列,利用Primer3批量設計引物,設計引物參數(shù)為GC含量40%~60%,退火溫度Tm為50~60℃,引物長度18~25 bp,目的片段預期100 bp以上,符合引物設計條件的序列148479條,占含SSR重復基元序列數(shù)的52.5%。這些序列構成了后續(xù)進行大規(guī)模SSR引物開發(fā)的序列基礎。

    2.2 蒙古櫟SSR引物的確定

    作為初步研究,隨機挑選合成40對引物進行篩選和驗證,最終篩選出10對重復性好的SSR引物(表2),其中7個位點的重復基元為3核苷酸重復,4核苷酸重復位點有3個。從重復基元的類型看,位點N1014482和N4544558重復核苷酸類型是一樣的(AAT),位點N1010265和N1110207是CAA重復,位點N1105306和N4529840的重復類型是相同的(TTC),其余4個位點的重復基元序列均不同。

    2.3 毛細管電泳熒光檢測

    為驗證這些引物是否在群體中具有多態(tài)性,利用采自遼寧不同地區(qū)的8個蒙古櫟樣本進行擴增驗證。圖1所示為引物對N1010265的熒光擴增產(chǎn)物在自動測序儀上的條帶大小,模板分別來自采集的8個地區(qū)樣本,橫坐標為擴增的片段大小,縱坐標為擴增產(chǎn)物的熒光強度。從圖中可以看出,總體信號清晰,8個DNA樣品的電泳峰型各異,呈現(xiàn)出較好的多態(tài)性。統(tǒng)計結果表明,這10個SSR位點均為多態(tài)性位點(表2),等位基因數(shù)最高的是N1457047位點,達到6個??傮w上,片段大小范圍為135~215 bp,片段最長的位點是N4529840,為200~215 bp;片段最短的是N1345390和N12361位點,擴增長度分別為135~153、139~152 bp。

    圖1 利用引物N1010265對8個樣品擴增的峰值圖

    表2 蒙古櫟10對SSR引物信息

    2.4 新開發(fā)SSR標記群體內檢測

    為進一步驗證新開發(fā)SSR引物的有效性,選用10對引物對采集自撫順大孤家地區(qū)的15個蒙古櫟材料進行擴增,結果表明,15個材料的遺傳距離在0.689~0.919之間(表3),說明在同一地區(qū)群體內存在一定的遺傳變異,通過計算得出該群體平均等位基因數(shù)為4.2個,有效等位基因數(shù)為2.7個,Shannon多樣性指數(shù)為1.104,從結果可見蒙古櫟群體遺傳多樣性處于較高水平。

    表3 15個蒙古櫟材料遺傳距離

    3 結論與討論

    SSR標記的開發(fā)需要預先知道側翼序列信息以設計引物進行PCR擴增,這些序列通常利用一代測序方法獲得,檢測方法也是低通量的聚丙烯酰胺凝膠電泳。因此,傳統(tǒng)的SSR標記開發(fā)引物通常都涉及一系列繁復的基因組建庫、重復片段富集、雜交、多個克隆篩選和桑格測序等操作步驟[18],效率較低成本較高,使得SSR標記僅在模式植物或者是經(jīng)濟價值較高的植物上得到開發(fā)和應用[19]。隨著新一代測序技術帶來的高通量優(yōu)勢,測序效率大大提高,對物種的基因組和轉錄組進行大規(guī)模測序和細致分析成為簡單易行的方法,給SSR標記的開發(fā)也帶來了很大便利[20-21];另一方面,隨著多色熒光標記檢測技術的廣泛應用,SSR片段的記錄和分析可以實現(xiàn)自動化,檢測效率、準確率和重復性得到明顯改進[22]。本研究利用高通量測序技術,在較短時間內開發(fā)了10對蒙古櫟專屬SSR引物,對SSR新位點多態(tài)性驗證表明,每個位點的等位基因數(shù)為4~6,平均為4.5個,且均具有較好多態(tài)性,這將為下一步分析遼寧地區(qū)分布的蒙古櫟群體遺傳多樣性和遺傳改良提供技術基礎。

    鑒于SSR標記的優(yōu)點,研究人員十分關注SSR標記引物的開發(fā)。就SSR引物的來源看,一種是來源于近緣物種間的通用性引物,這種方法雖然方便、快捷、經(jīng)濟,但是存在很大的物種局限性,原物種的SSR基因位點在其他物種間轉移擴增時,存在未知性和同源性問題,盲目性較大。另一種則是基于各種方法開發(fā)物種特有SSR位點。開發(fā)特有SSR標記的方法各具優(yōu)勢,常用方法如基于ISSR-PCR開發(fā)SSR標記、基于EST序列開發(fā)SSR標記等,本研究是基于基因組de novo拼接序列數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標記,鑒定的10個SSR位點中,三基元的占了70%,其中CAA基元和TTC基元相對占比較高,與前人開發(fā)的櫟屬SSR標記特征有所不同[23-25],這可能與此次統(tǒng)計的SSR位點相對較少,且在引物設計時剔除了復合型和非完全型的SSR位點有關,將在今后蒙古櫟SSR標記開發(fā)中做進一步研究。

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