PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用探討

丁 磊 田 虎 柳吉芹

1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心承德業(yè)務(wù)部 河北 承德 067000

2.石家莊海關(guān)技術(shù)中心曹妃甸業(yè)務(wù)部 河北 唐山 063200;3.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心 河北 秦皇島 066004

引言

PCR技術(shù)在食品微生物的檢測(cè)當(dāng)中有著十分廣泛的應(yīng)用。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)于目標(biāo)微生物的精確篩選，并能夠鑒定食品當(dāng)中的微生物種類。PCR技術(shù)能夠?qū)习傩涨袑?shí)關(guān)心的食品安全問(wèn)題提供技術(shù)手段。通過(guò)PCR技術(shù)能夠?yàn)榘傩詹妥捞峁┦称樊?dāng)中的微生物指標(biāo)檢測(cè)依據(jù)，該技術(shù)在食品安全方面的應(yīng)用能夠提高對(duì)于微生物指標(biāo)檢測(cè)的效率和質(zhì)量。

一、PCR原理與技術(shù)

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的工作原理是根據(jù)DNA模板當(dāng)中的特性進(jìn)行模仿并復(fù)制。在一定的條件之下，以單鏈DNA作為模板進(jìn)行復(fù)制的過(guò)程當(dāng)中，利用人工合成的寡核苷酸作為引物，或者是根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制定適合的寡核苷酸作為引物。還能夠有效利用耐熱DNA聚合酶促使該復(fù)制過(guò)程的完成。在整個(gè)復(fù)制過(guò)程當(dāng)中，通常會(huì)用到20～40個(gè)PCR循環(huán)。每一個(gè)PCR循環(huán)當(dāng)中都會(huì)分為三個(gè)步驟進(jìn)行工作。高溫變性、低溫再生、適當(dāng)溫度擴(kuò)展，每一部分當(dāng)中PCR都會(huì)進(jìn)行對(duì)應(yīng)的工作，從而保證DNA能夠得到有效復(fù)制。在高溫環(huán)境之下，隨著DNA的變性，氫鍵就能夠被打開，讓雙鏈變?yōu)閱捂?。在低溫條件之下，寡核苷酸引物以其自身的特異性互補(bǔ)并聯(lián)結(jié)單鏈DNA模板，促使DNA再生。適當(dāng)溫度當(dāng)中PCR循環(huán)也在進(jìn)行著工作。DNA聚合酶以單鏈DNA作為模板，沿著規(guī)定的方向進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，除此之外，還能夠在不同的方向中插入核苷酸，使相關(guān)引物延展合成模板的互補(bǔ)鏈。經(jīng)過(guò)多樣化的變性再生與擴(kuò)展，PCR循環(huán)不斷完成自身工作，有效擴(kuò)展著DNA片段[1]。

引物:引物是PCR工作過(guò)程當(dāng)中所需要運(yùn)用的物質(zhì)之一。想要成功的擴(kuò)增DNA片段其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸就需要引物在之間作為連接的橋梁。引物自身具有一定的特殊性，也正是因?yàn)樽陨淼奶厥庑砸锊拍軌蛲ㄟ^(guò)PCR反應(yīng)過(guò)程擴(kuò)增特異性。除此以外，引物的設(shè)計(jì)以及合成的質(zhì)量都對(duì)PCR擴(kuò)增有著最為直觀的影響。在正常情況下，引物應(yīng)當(dāng)位于要分析的DNA組當(dāng)中最為保守的區(qū)域，一般引物的長(zhǎng)度大概為15～30個(gè)堿基。由于引物之間不能夠進(jìn)行互補(bǔ)，每個(gè)引物當(dāng)中的堿基都不能夠過(guò)分的重復(fù)連續(xù)。不僅如此，自身的發(fā)夾結(jié)構(gòu)也不能由引物構(gòu)成。引物當(dāng)中的特定tm值應(yīng)盡量接近以及GC含量不能過(guò)高。

dNTPs:dNTP是4個(gè)核苷酸的混合物，是PCR反應(yīng)所需的底物。當(dāng)四個(gè)核苷酸的濃度相同時(shí)，核苷酸在PCR工作循環(huán)當(dāng)中的摻入錯(cuò)誤率可以降級(jí)到最小化。一般來(lái)說(shuō)，dNTP在濃度為0.2mol/L時(shí)能夠更好的完成擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度以及堿基組成的確定[2]。

DNA聚合酶:當(dāng)前，用于PCR擴(kuò)增的最常用的DNA聚合酶是Thermus aquaicus生產(chǎn)的TagDNAase，它具有出色的熱穩(wěn)定性，可以承受94攝氏度的高溫，并且在該溫度下很短。最佳反應(yīng)溫度為72攝氏度，在70攝氏度時(shí)催化核酸鏈擴(kuò)展的速率為2800個(gè)核苷酸/分鐘。通常，在100l反應(yīng)系統(tǒng)中通常會(huì)使用兩個(gè)單位DNA聚合酶，所使用的DNA聚合酶數(shù)量對(duì)PCR擴(kuò)增效率以及其特異性都有著十分重要的影響。PCR技術(shù)正在持續(xù)發(fā)展過(guò)程當(dāng)中，除了tag DNA聚合酶之外，耐熱PFU DNA聚合酶已經(jīng)能夠廣泛應(yīng)用到PCR反應(yīng)當(dāng)中。PFU DNA聚合酶是一種在高溫環(huán)境之下成年熱球菌產(chǎn)生的DNA聚合酶。到目前為止，這是耐熱性DNA聚合酶的最高速率，但擴(kuò)增速率比TagDNA聚合酶低550個(gè)核苷酸/分鐘。此外，還使用了r Tth DNA聚合酶，為了能夠讓DNA模板能夠在PCR反應(yīng)當(dāng)中順利進(jìn)行擴(kuò)增，在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)之前需要對(duì)相對(duì)應(yīng)的RNA片段進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。r TthDNA聚合酶可以結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和聚合反應(yīng)。一種可在RNA逆轉(zhuǎn)錄后直接擴(kuò)增大量DNA片段的片段，大大減少了操作步驟并提高了效率[3]。

緩沖液:目前最為常用的PCR緩沖體系為10-50mmol/L Tris-HCl(p H 8.3-8.8)系統(tǒng)。每種Tag酶都有相同的反應(yīng)緩沖液，因此通常不建議將該緩沖液與其他制造商的Tag酶交叉使用。

Mg+:Mg+其濃度明顯影響PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量，Mg+可以與陰離子(陰離子基團(tuán)如磷酸鹽)進(jìn)行結(jié)合，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中，從引物、DNA模板或d NTPs當(dāng)中都能夠獲得磷酸鹽，因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)腗g+以達(dá)到最佳反應(yīng)效果，濃度通常為2-5mmol/L。

核酸模板:核酸模板是PCR反應(yīng)當(dāng)中的重要組成部分之一。PCR反應(yīng)的過(guò)程當(dāng)中，一般都利用細(xì)菌進(jìn)行，一般的反應(yīng)模板來(lái)源DNA是染色體或質(zhì)粒。使用染色體的DNA作為模板的PCR擴(kuò)增過(guò)程當(dāng)中，所需要的標(biāo)記酶數(shù)量相對(duì)較大，對(duì)于模板DNA的純度要求會(huì)更高。并且在反應(yīng)的過(guò)程當(dāng)中不會(huì)存在抑制性的DNA聚合酶活性蛋白酶。通常，PCR反應(yīng)系統(tǒng)所需的模板量是目標(biāo)序列的102-105拷貝。

二、將PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)

(一)用于檢測(cè)食品樣本中的致病菌。傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法步驟繁瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，首先，必須將樣品濃縮并培養(yǎng)以檢測(cè)微生物，并且只有在樣品達(dá)到可檢測(cè)水平后，才能分離微生物，觀察形態(tài)學(xué)特征并進(jìn)行生化鑒定。而且，常規(guī)樣品不能檢測(cè)難以手動(dòng)生長(zhǎng)的微生物。在所有細(xì)菌環(huán)境當(dāng)中，編碼rRNA的基因處于一種高度保守的狀態(tài)，因此可以用PCR方法擴(kuò)增其DNA片段，從而更加快速敏捷的對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。值得一提的是，對(duì)檢測(cè)那些無(wú)法進(jìn)行人工操作培養(yǎng)的細(xì)菌或者病原體微生物，PCR方法的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)的更加明顯。想要讓PCR反應(yīng)能夠更好的為食品檢測(cè)服務(wù)，就需要在準(zhǔn)備過(guò)程當(dāng)中，提取出一定的目標(biāo)DNA。憑借離心或者是過(guò)濾的方式進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞獲取，之后對(duì)其進(jìn)行裂解，然后對(duì)得到的裂解細(xì)胞進(jìn)行核酸的純化。使其適合于PCR反應(yīng)。[4]。也可以直接將樣品中的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解來(lái)得到核酸。

(二)用于檢測(cè)飲用水中的指示菌。水質(zhì)測(cè)試基于對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。常規(guī)的檢測(cè)方法是培養(yǎng)革蘭氏陰性細(xì)菌和可以使用乳糖的細(xì)菌的方法，并且該檢測(cè)方法很復(fù)雜并且需要幾天的時(shí)間。然而，一些大腸桿菌菌株不表達(dá)-葡糖醛酸糖苷酶，因此有時(shí)會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)失敗。PCR技術(shù)為檢測(cè)-半乳糖苷酶(lac)和-葡萄糖醛酸苷酶(uid)基因提供了更加靈敏的方式。lacZ和uid A基因的在進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程當(dāng)中，分別需要對(duì)水樣當(dāng)中的大腸菌群和大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。通常，擴(kuò)增的lacZ同樣適用于同類型的生物進(jìn)行選擇性的培養(yǎng)辦法，而擴(kuò)增的uid A可以檢測(cè)大腸桿菌和瞪羚物種。因此，PCR方法更加靈敏。此外，在使用水源之前使用PCR檢測(cè)細(xì)菌更為安全，因?yàn)镻CR反應(yīng)可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。

(三)用于檢測(cè)和鑒定乳酸菌。通過(guò)比較32種現(xiàn)有雙歧桿菌和相關(guān)物種的16S rRNA基因的序列，不難發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸序列通常位于1412到1432位。這樣的發(fā)現(xiàn)在所有雙歧桿菌當(dāng)中都是同樣存在的，這一寡核苷酸序列可以作為雙歧桿菌進(jìn)行特定的寡核苷酸片段。這一特定的寡核苷酸片段可以作為擴(kuò)增雙歧桿菌16SrRNA基因片段進(jìn)行PCR反應(yīng)的引物。在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)通常采用簡(jiǎn)單的形式，用SDS進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞的裂解，之后利用蛋白酶k作為去除多余蛋白質(zhì)的作用物，以此獲得樣板DNA。在該條件下，雙歧桿菌都可以通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)其模板復(fù)制、擴(kuò)增，從而產(chǎn)生典型的1.35kb的核苷酸片段，該類型的片段只有雙歧桿菌產(chǎn)生，其他的細(xì)菌則不會(huì)產(chǎn)生該條帶。因此雙歧桿菌可以利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)、鑒定和分類乳酸菌。

三、結(jié)束語(yǔ)

簡(jiǎn)而言之，由于PCR技術(shù)可以快速，特異性地?cái)U(kuò)增所需的DNA片段和靶基因，在很多領(lǐng)域當(dāng)中都發(fā)揮著十分重要的作用。尤其在近期發(fā)生的新冠肺炎疫情中，PCR技術(shù)在檢測(cè)新型冠狀病毒核酸領(lǐng)域也發(fā)揮著重要的作用。這也就是為什么PCR技術(shù)的發(fā)展會(huì)得到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。