一株溶磷促生菌的分離、鑒定及其對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

張芬芬，周曉倫，賀洋洋

（甘 肅醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000）

【研究意義】糧食生產(chǎn)對(duì)人類(lèi)生存至關(guān)重要，玉米（Zea maysL.）是世界重要的糧食作物之一，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)以及畜牧業(yè)中［1］。氮、磷參與植物光合作用、營(yíng)養(yǎng)吸收、細(xì)胞分裂和生物氧化等重要代謝途徑，是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素［2］。為了滿足農(nóng)作物生存、生產(chǎn)所需的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，幾乎所有的土壤都需要化肥來(lái)補(bǔ)充無(wú)機(jī)磷支持作物生產(chǎn)，但反復(fù)使用化肥會(huì)導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)惡化［3］，而且土壤中95%的磷的存在形式難以被植物吸收利用［4］。因此，分離和利用土壤溶磷微生物，促進(jìn)植物吸收磷元素，應(yīng)用微生物肥料替代部分化肥逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的研究熱點(diǎn)。植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）是指定殖于植物根際系統(tǒng)，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量的一類(lèi)細(xì)菌的總稱［5］。PGPR 在促進(jìn)作物固氮能力、改善土壤環(huán)境以及提高植物抗病抗逆能力等方面有重要研究意義［6］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究報(bào)道關(guān)于植物根際促生菌的固氮、溶磷、產(chǎn)氨作用，溶磷菌可以釋放有機(jī)酸、螯合和離子交換使土壤中的不溶性磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷，以提高土壤肥力［7-9］。溶磷劑對(duì)糧食和飼料作物也有部分相應(yīng)的促進(jìn)作用［10-12］。大量的文獻(xiàn)主要說(shuō)明了根際促生菌其自身的促生作用和菌株的生理特征，但促生菌對(duì)植株-土壤-微生物整個(gè)體系作用的研究相對(duì)很少［13］。【本研究切入點(diǎn)】隴東地區(qū)對(duì)PGPR 菌株作為生物菌肥應(yīng)用到農(nóng)作物中以及促生效應(yīng)的研究甚少。篩選一批促生作用顯著的根際植物促生菌，可為進(jìn)一步利用微生物-植物促生相互作用促進(jìn)農(nóng)作物的增長(zhǎng)，提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源，提高糧食產(chǎn)量，減少化學(xué)肥料對(duì)土壤特征的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為探索PGPR對(duì)土壤中無(wú)機(jī)磷的溶磷能力以及植物的促生作用機(jī)制，本試驗(yàn)以冬小麥根際土壤為研究材料篩選具有溶磷能力和產(chǎn)生促生效應(yīng)物質(zhì)的菌株，采用改良的Belimov 方法獲得一株顯著促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)的菌株，通過(guò)16S rRNA 基因序列及表型分析鑒定其為Pseudomonassp，其作為優(yōu)質(zhì)的菌種資源，可促進(jìn)農(nóng)作物產(chǎn)量的提高和改善局部土壤的理化特征，擴(kuò)大了生物菌肥的資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土樣采集自冬小麥根際土壤5～15 cm 的土層。

試驗(yàn)使用的化學(xué)藥品均為分析純，均由西安姚北生物科技有限公司提供。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.00 g，酵母膏5.00 g，NaCl 10.00 g，瓊脂20.00 g，H2O 1 L，調(diào)節(jié)pH 為7.0，用于觀察溶磷菌的菌落特征。

改良SRSM 培養(yǎng)基［14］：瓊脂15 g，Glucose 10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO40.004 g，F(xiàn)eSO40.002 g，NaCl 20 g，Yeast extract 0.5 g，Bromocresol purple 0.1 g，加蒸餾水至1 L，調(diào)節(jié)pH 為6.8～7.0，用于溶磷菌株的分離、純化。

1.2 溶磷菌株篩選

取采集的冬小麥根際土壤10 g，加入到100 mL（含有25～35 個(gè)玻璃珠）的LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置振蕩器上震蕩15 min，得到10-1 濃度的土壤稀釋液，連續(xù)稀釋至10-6，將10-1～10-6梯度的土壤稀釋液均勻涂布于SRSM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30（±2）℃，倒置、恒溫培養(yǎng)3～5 d。菌落周?chē)舫霈F(xiàn)溶磷圈即為溶磷菌，挑取具有明顯溶磷圈的菌株進(jìn)行純化，重復(fù)3 次，直至顯微鏡中觀察出現(xiàn)形態(tài)、大小一致的細(xì)菌。將其保存4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 溶磷菌株鑒定

1.3.1 菌株形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn) 菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色特性參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行觀察，菌株的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及相關(guān)文獻(xiàn)鑒定［15］。

1.3.2 16S rDNA 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 分別提取菌株的總基因DNA，采用16S rDNA 通用引物27f（5'-AGAGTTT-G-ATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物送西安擎科生物公司完成16S rDNA 擴(kuò)增及序列測(cè)定。提交菌株的16S rDNA序列到NCBI 網(wǎng)站，與已知的序列比對(duì)分析其同源性。利用Blast 將序列進(jìn)行比對(duì)，MEGA5.05 分子進(jìn)化遺傳分析軟件分析堿基組成、GC 含量，Kimura2 參數(shù)計(jì)算遺傳距離，采用NJ 鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 溶磷菌株ACC 脫氨酶酶活性和產(chǎn)IAA 能力測(cè)定

參照 Penrose 等［16］的方法，ACC 脫氨酶的活性通過(guò)ACC 脫氨酶分解ACC 產(chǎn)生的α-酮丁酸來(lái)測(cè)定。菌體蛋白含量根據(jù)Bradford［17］的方法測(cè)定。根據(jù)α-酮丁酸和蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測(cè)算ACC 脫氨酶的活性。

參照Glickman 等［18］的方法，將分離純化的菌株分別接種于添加 L-色氨酸、終濃度為0.5 g/L 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)2 d，離心后取50 μL 上清液加入等體積Sackowcki's 顯色劑，在白瓷板上避光顯色30 min后觀察，若顯示粉紅色即為陽(yáng)性，表明該菌株能夠分泌IAA。

定量測(cè)定：取陽(yáng)性菌株的上清液與Sackowcki's 顯色劑避光顯色30 min 后的混合液，測(cè)定在530 nm 的吸光值，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)曲線以純IAA 的吸光值制作，計(jì)算各反應(yīng)中的陽(yáng)性菌株產(chǎn)IAA 的量（μg/mL）［19］。

1.5 根際細(xì)菌溶磷能力測(cè)定

1.5.1 定性測(cè)定 待測(cè)菌株在改良SRSM 固體培養(yǎng)基上活化，然后用接種針點(diǎn)接菌株至改良的SRSM固體培養(yǎng)基，每菌株在一個(gè)皿上接4個(gè)重復(fù)，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d 后觀察菌株周?chē)欠裼型该魅Ξa(chǎn)生。

1.5.2 定量測(cè)定 不加磷的改良SRSM 液體培養(yǎng)基100 mL 分裝在250 mL 三角瓶中，滅菌后精確加入0.5 g 滅菌的Ca3（PO4）2粉、1 mL（1×108CFU/mL）培養(yǎng)24 h 菌液，28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)，分別在48、72、96、120、144 h 測(cè)定菌株溶解無(wú)機(jī)磷能力［14］。吸取2 mL 混勻菌株培養(yǎng)液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液采用鉬銻抗比色法測(cè)定其溶磷量［20］，同時(shí)用酸度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH 值。每菌株3 次重復(fù)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不接種菌株）為對(duì)照。根據(jù)磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線確定菌株的溶磷量。

1.6 溶磷菌株對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的 影響

于2019 年5—6 月進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，供試土壤來(lái)自平?jīng)鲛r(nóng)田，供試作物為玉米。試驗(yàn)設(shè)接種ZX-10、ZX-3、ZX-40、ZX-7、ZX-701、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 及不接種任何菌劑對(duì)照9個(gè)處理，5 次重復(fù)。供試菌株分別活化后置于LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108CFU/mL，采用灌根方式進(jìn)行接種，接 種量10 mL/株。自然條件下室內(nèi)培養(yǎng)，每隔5 d重復(fù)處理1 次，整個(gè)試驗(yàn)期間保持土壤濕潤(rùn)，30 d 后收獲植株測(cè)定生物學(xué)數(shù)據(jù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 one-way ANOVA 進(jìn)行分析，采用Fisher's Student-Newman -Keulsa,b進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌株的篩選

將分離純化的菌株以稀釋涂布的方式接種于改良SRS M 固體培養(yǎng)基5 d 后，測(cè)定菌落直徑和溶磷圈直徑，根據(jù)溶磷圈大小篩選到8 株具有溶磷能力的菌株，其對(duì)應(yīng)平板上都觀察到明顯的溶磷圈。其中，ZX-2020 菌落直徑為2.3 mm，溶磷圈直徑為4.8 mm（圖1 中箭頭所示），計(jì)算得SI=2.08，為8 株菌株中最大，因此對(duì)ZX-2020 平板上的溶磷菌株進(jìn)行純化和傳代培養(yǎng)，表明菌株純度和溶磷能力穩(wěn)定。

圖1 菌株ZX-2020 的溶磷圈Fig.1 Phosporous-solubilizing halos of strain ZX-2020

2.2 溶磷菌株的菌體形態(tài)特征和生理生化特性

菌株ZX-2020 為乳白色或淡黃菌落，表面光滑，半透明，濕潤(rùn)粘稠，圓形，邊緣規(guī)則，革蘭氏染色陰性，具運(yùn)動(dòng)性。生化反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1。另外，在SRSM 液體培養(yǎng)基中，菌株ZX-2020 在pH 6.5～11.5 之間均可生長(zhǎng)，在37 ℃下生長(zhǎng)狀況最好。根據(jù)菌體形態(tài)特征和生理生化，菌株 ZX-2020 為Pseudomonasspp.

表1 溶磷菌株P(guān)seudomonas sp.ZX-2020 的形態(tài)特征和生化反應(yīng)Table 1 Morphological characteristics and biochemical reactions of Ps eud omonas sp.strain ZX-2020

2.3 菌株ZX-2020 16S rDNA 序列測(cè)定

為了鑒定菌株的生理生化特性，以菌株ZX-2020 的總DNA 為模板，利用細(xì)菌16S rDNA 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1.5 kb 的擴(kuò)增產(chǎn)物。將此序列提交至Genbank，獲得的登錄號(hào)為MT084758。根據(jù)Genbank 序列同源性比較，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Blast 功能進(jìn)行核苷酸比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株ZX-2020 與Pseudomonas aeruginosastrain P1（MK881024.1）、Pseudomonas aeruginosastrain LCS1（MK430420.1）及Pseudomonas aeruginosastrain BUYA-2（MN490066.1）的16S rDNA 基因序列一致性均高達(dá)100%。根據(jù)16S rDNA 基因序列的相似性，利用MEGA5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），顯示菌株ZX-2020 在系統(tǒng)發(fā)育上最接近于銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginosa）。

圖2 基于菌株ZX-2020 16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA gene sequence of strain ZX-2020

2.4 菌株ZX-2020 ACC 脫氨酶活性和產(chǎn)IAA能力

植物促生菌可以定植在植物的根以及種子表面，菌株產(chǎn)生的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶可降解乙烯的前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸，從而降低乙烯在植物體內(nèi)的含量，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。IAA 也可通過(guò)直接刺激植物細(xì)胞的延伸和分裂，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)并提高植物自身的防御系統(tǒng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，Pseudomonasspp.ZX-2020溶磷量為198.26（±10.04）μg/mL，ACC 脫氨酶活性為152.62（±7.21）μmol/mg·h，產(chǎn)IAA 量為6.71（±0.32）mg/L，具有較高的產(chǎn)IAA 能力。

2.5 菌株ZX-2020 溶磷能力

難溶性磷在酸性土壤中會(huì)轉(zhuǎn)化成磷酸鋁和磷酸鐵，在石灰性土壤中會(huì)轉(zhuǎn)化為磷酸鈣，而溶磷微生物能把此類(lèi)難溶性磷轉(zhuǎn)化成植物可以吸收利用的有效磷。為了 分析測(cè)試菌株ZX-2020 轉(zhuǎn)化土壤中難溶性磷酸鹽并且改善土壤的供磷能力，將菌液與供試土壤按照10%的比例進(jìn)行混合，3 d后，土壤中的有效磷含量從最初的8.63 mg/kg 上升為12.66 mg/kg。起初的土壤有效磷含量比較少，屬于低能力供磷水平，在施加菌株ZX-2020 后，土壤有效磷含量明顯增加，達(dá)到中等供磷水平，證明菌株ZX-2020 可以改善土壤的供磷水平。

2.6 菌株ZX-2020 對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

通過(guò)不同溶磷菌株對(duì)幼苗進(jìn)行灌根處理，30 d 后測(cè)定植株的生理生長(zhǎng)指標(biāo)。盆栽試驗(yàn)顯示，與對(duì)照相比，接種ZX-7、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 菌株的幼苗根長(zhǎng)均顯著增長(zhǎng)，接種ZX-40、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 菌株的幼苗莖長(zhǎng)均顯著增長(zhǎng)，接種ZX-40、ZX-701、ZX-30、ZX-401、ZX-2020 的幼苗鮮重均顯著增加，接種ZX-10、ZX-7、ZX-2020 菌株的幼苗葉面積均顯著增加（表2）。表明接種8 種菌株的玉米幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、鮮重、葉面積均有不同程度的增加，以ZX-2020 菌株的促生效應(yīng)更為突出，接種ZX-2020 菌株的玉米幼苗根長(zhǎng)增長(zhǎng)54.49%，莖長(zhǎng)增長(zhǎng)26.96%，鮮重增加1.93%，葉面積增加36.06%。同時(shí)，接種溶磷菌株的幼苗植株與對(duì)照相比根部生長(zhǎng)更為旺盛，根毛數(shù)更多，根須更長(zhǎng)，根系更為發(fā)達(dá)。

表2 8 株溶磷菌株對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of 8 phosphorus-solubilizing strains on the growth of Zea mays L. seedlings

3 討論

土壤、根系及微生物三者相互作用的區(qū)域稱為植物根際［21］，植物根系可分泌大量的糖類(lèi)、氨基酸、激素和維生素，根際細(xì)菌的定植在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和溶解等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［22］。大多數(shù)的解磷、溶磷菌都可以促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量、增強(qiáng)抗病力［23］，假單胞菌屬作為主要溶磷微生物之一，很多研究都表明假單胞桿菌屬菌株對(duì)難溶性磷酸鹽有較好的溶磷效果。郭瑩等［24］研究表明銅綠假單胞菌JM1對(duì) 磷酸鈣和磷酸鋁的溶磷量分別達(dá)到240.63 和2.73mg/L。孫珊等［25］篩選的一株假單胞菌屬菌株CJT-1 對(duì)磷酸鈣和宜昌磷礦粉的溶磷量分別達(dá)到224.51 和120.59 mg/L，劉輝等［26］篩選的一株熒光假單胞菌JW-JS1 對(duì)磷酸鈣的溶磷量最高達(dá)708.34 mg/L。本研究篩選得到的ZX-2020 菌株對(duì)磷酸鈣溶的溶磷量為198.26 mg/L，該菌株對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解能力與上述報(bào)道的結(jié)果相近，甚至效果更優(yōu)。溶磷菌的溶磷機(jī)理非常復(fù)雜，有的溶磷菌通過(guò)釋放質(zhì)子來(lái)降低土壤pH 值而達(dá)到降磷效果，部分溶磷菌通過(guò)分泌有機(jī)酸而起到溶磷作用，也有溶磷菌通過(guò)分泌磷酸酶來(lái)溶磷，或者是多種機(jī)制并存起到的綜合作用［27-28］。目前，大部分研究認(rèn)為真菌溶磷的能力主要與其向培養(yǎng)基中分泌的小分子有機(jī)酸有關(guān)，分泌有機(jī)酸一方面可以降低培養(yǎng)基pH利于難溶性磷酸鹽的溶解，另一方面可以通過(guò)結(jié)合鐵鎂鈣鋁等離子將磷酸鹽釋出來(lái)［29-30］，因此造成不同濃度的溶磷菌株溶解能力的差異可能與金屬離子的螯合能力不同或其分泌的有機(jī)酸含量有關(guān)。溶磷菌劑的使用，直接增加其在土壤中的數(shù)量，有利于植物對(duì)磷素的吸收利用［31］。萬(wàn)水霞等［32］通過(guò)盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)土壤根際篩選出的優(yōu)良PGPR 菌株（CH70）對(duì)莧菜的株高及地上部鮮重都有一定的促進(jìn)作用，并且從根際土壤分離獲得的溶磷菌株，其菌劑能有效促進(jìn)苗期生長(zhǎng)和增加產(chǎn)量［33］。陳佳怡等［34］對(duì)水稻根際土壤進(jìn)行溶磷菌篩選純化，分離得到的假單胞菌有高效的溶磷能力，可用來(lái)研制微生物菌肥。在隴東地區(qū)，過(guò)量使用化肥使農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境遭到破壞，迫切需要綠色高效的生物菌肥代替化肥，因此，在今后的研究中，改善土壤微環(huán)境，溶磷微生物能夠推動(dòng)土壤中有效磷的釋放，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，增加作物產(chǎn)量，篩選更多優(yōu)良PGPR 菌株尤為重要。

4 結(jié)論

本研究從平?jīng)鍪谢适┯枚←溚寥乐谐醪胶Y選分離得到8 株溶磷菌株，通過(guò)植物促生試驗(yàn)得到一株溶磷能力強(qiáng)（198.26 mg/L）、產(chǎn)吲哚乙酸（6.71 mg/L）、ACC 脫氨酶活性強(qiáng)（152.62 μmol/mg·h）的銅綠假單胞菌屬，可以作為生物菌肥應(yīng)用到農(nóng)耕活動(dòng)中，不但可以增加農(nóng)作物對(duì)磷元素的吸收，而且吲哚乙酸也可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，ACC 脫氨酶可以幫助植物抵抗非生物脅迫條件，如重金屬、干旱、高鹽等，增加植物的抗逆性。當(dāng)ZX-2020 菌株進(jìn)入土壤中定殖于植物根系后，產(chǎn)生的吲哚乙酸、ACC 脫氨酶和溶解無(wú)機(jī)磷的能力相互作用，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高農(nóng)作物的生物量，同時(shí)也為化肥土壤的生物修復(fù)提供了菌種資源。