牛Bcl-2基因生物信息學(xué)功能預(yù)測(cè)分析

丁嘉怡，郭慧玲，羅一鳴，康文林，李 康，李谷月

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045）

Bcl-2蛋白是到現(xiàn)今為止研究最為深入的抗凋亡蛋白之一，可以與促凋亡蛋白結(jié)合，抑制促凋亡蛋白的寡聚及之后的MOMP（mitochondrial outer membrane permeabilization）發(fā)生，進(jìn)而阻斷線(xiàn)粒體途徑的凋亡［1］。近些年的研究表明，通過(guò)線(xiàn)粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要由Bcl-2蛋白家族成員之間復(fù)雜的相互作用進(jìn)行調(diào)控［2］。除此之外，Bcl-2可能參與了Bax誘導(dǎo)凋亡的下調(diào)途徑且與細(xì)胞色素C的釋放無(wú)關(guān)［3-4］，Bax蛋白與Bcl-2蛋白以不同比例形成異二聚體可能決定了細(xì)胞凋亡的敏感性［5］，Bcl-2/Bax比值增大，會(huì)激發(fā)線(xiàn)粒體膜電位下降或丟失，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［6］。

有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因不僅能調(diào)控凋亡，還可通過(guò)結(jié)合細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子Beclin1對(duì)細(xì)胞自噬起到調(diào)控作用［7］。劉會(huì)娟等［8］指出，Bcl-2蛋白影響Ca2+在細(xì)胞內(nèi)的分布，Ca2+能夠激活核酸內(nèi)切酶，而B(niǎo)eclin1及Ca2+信號(hào)通路參與自噬調(diào)節(jié)［9-10］，Beclin1的表達(dá)明顯上調(diào)和胞內(nèi)Ca2+濃度升高會(huì)導(dǎo)致自噬增強(qiáng)［11］。此外也有報(bào)道，Bcl-2家族蛋白的抑制可引起細(xì)胞過(guò)多死亡，細(xì)胞死亡依賴(lài)于自噬機(jī)制，這可能是平衡自噬活動(dòng)的重要機(jī)制之一［12-13］。這說(shuō)明Bcl-2在細(xì)胞凋亡與自噬過(guò)程中發(fā)揮交叉性作用。

對(duì)Bcl-2蛋白的抑制表達(dá)以及影響細(xì)胞死亡的作用研究是最近幾年的研究熱點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物中，一些Caspase蛋白酶形成了蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Bcl-2蛋白通過(guò)阻止導(dǎo)致Caspase蛋白酶激活的步驟阻止細(xì)胞死亡，排除了Bcl-2蛋白和Bcl-XL（B-Cell Leukemia/Lymphoma 2 XL）通過(guò)在Caspase蛋白酶的下游起作用來(lái)防止細(xì)胞死亡的可能性［14-15］，其可能通過(guò)組織結(jié)構(gòu)損傷途徑將細(xì)胞凋亡信號(hào)下傳。

本試驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用生物信息分析預(yù)測(cè)及算法配合，預(yù)測(cè)牛的Bcl-2基因及其編碼蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 基因序列

牛源Bcl-2基因序列（編號(hào)NC_037351.1）及編碼蛋白的氨基酸序列（編號(hào)NP_001159958.1），自NCBI網(wǎng)站上獲得。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

采用BioEdit軟件進(jìn)行牛Bcl-2基因序列預(yù)測(cè)分析，分析目標(biāo)基因序列組成。采用NCBI在線(xiàn)網(wǎng)站Bcl-2基因進(jìn)行核酸基本分析，對(duì)Bcl-2基因所在基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用NCBI上的BLAST工具包進(jìn)行核苷酸的初步同源性分析。

采用NCBI在線(xiàn)程序預(yù)測(cè)牛Bcl-2基因所編碼的氨基酸序列，采用BioEdit軟件分析目標(biāo)氨基酸組成。使用NCBI-BLAST進(jìn)行牛Bcl-2蛋白同源性比對(duì)。運(yùn)用在線(xiàn)工具ExPASy-ProtParam tool預(yù)測(cè)氨基酸與水結(jié)合的性質(zhì)。將TMHMM Server v.2.0與SPLIT 4.0工具聯(lián)合使用進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)。根據(jù)SignalP 4.1 Server對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。運(yùn)用在線(xiàn)工具PSORTⅡ進(jìn)行Bcl-2蛋白分子亞細(xì)胞位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。利用NCBI的CD-Search對(duì)Bcl-2蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析。利用在線(xiàn)工具PSIpred-MEMSAT 3預(yù)測(cè)Bcl-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用SWISS-MODEL工具依據(jù)同源建模法構(gòu)建出Bcl-2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛Bcl-2基因的基因分析

2.1.1 牛Bcl-2基因序列預(yù)測(cè)分析運(yùn)用BioEdit軟件分析目標(biāo)基因序列的組成。預(yù)測(cè)到Bcl-2基因長(zhǎng)792 bp，單鏈分子質(zhì)量為241 755.00 Da，雙鏈分子質(zhì)量為483 515.00 Da。4種堿基含量分別為A，17.17%；C，32.70%；G，32.32%；T，17.80%；G+C，65.03%；A+T，34.97%。該核苷酸序列中C含量最高，A含量最少，見(jiàn)表1。牛Bcl-2基因核苷酸預(yù)測(cè)見(jiàn)圖1。

圖1 牛Bcl-2基因核苷酸預(yù)測(cè)

2.1.2 牛Bcl-2基因的核酸基本分析使用NCBI在線(xiàn)網(wǎng)站進(jìn)行Bcl-2核酸基本分析，對(duì)Bcl-2基因所在基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)Bcl-2基因在24號(hào)染色體上，外顯子計(jì)數(shù)為7。

圖2 牛Bcl-2基因的核酸基本分析

2.1.3 牛Bcl-2基因的同源性比對(duì)使用NCBIBLAST工具包進(jìn)行核苷酸的初步同源性分析。將牛與已公布的抹香鯨（登錄號(hào)XM_007105114.3）、小鰛鯨（登錄號(hào)XM_007192009.1）、虎鯨（登錄號(hào)XM_004268067.2）、太平洋短吻海豚（登錄號(hào)XM_027118704.1）、長(zhǎng)肢領(lǐng)航鯨（登錄號(hào)XM_030868121.1）、非洲野驢（登錄號(hào)XM_014843802.1）、山羊（登錄號(hào)KJ782301.1）、牦牛（登錄號(hào)MK050976.1）、北美野牛（登錄號(hào)XM_010854740.1）、印度牛（登錄號(hào)XM_019986619.1）、馬鐵菊頭蝠（登錄號(hào)XM_033087566.1）Bcl-2基因序列同源性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，該核苷酸序列高度保守，與牦牛（登錄號(hào)MK050976.1）同源性相似度在99.86%。

圖3 Bcl-2基因序列同源性比較

2.2 牛Bcl-2蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析

2.2.1 牛Bcl-2氨基酸序列的組成分析使用NCBI在線(xiàn)程序預(yù)測(cè)牛Bcl-2氨基酸序列，測(cè)得牛Bcl-2蛋白包含229個(gè)氨基酸，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 牛Bcl-2氨基酸序列

采用BioEdit軟件分析目標(biāo)氨基酸的組成，并運(yùn)用在線(xiàn)工具ExPASy-ProtParam tool分析Bcl-2蛋白基本理化性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表2。該蛋白質(zhì)的公式為C1132H1717N311O316S9，原子總數(shù)為3 485，理論pI為6.65，蛋白質(zhì)半衰期為30 h，不穩(wěn)定性指數(shù)為58.20，將蛋白質(zhì)分類(lèi)為不穩(wěn)定。脂肪指數(shù)為76.77，親水性平均值（GRAVY）為-0.133。氨基酸殘基數(shù)為229個(gè)，分子質(zhì)量為25 026.10 Da。其中丙氨酸（Ala）占26個(gè)，是占比最大的，為11.35%；其他依次是甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），這三種氨基酸含量分別占比9.61%、9.17%、9.17%；最少的是胱氨酸（Cys），僅占0.87%。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為21，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys+His）為27。消光系數(shù)以L(fǎng)/（g·cm）為單位，在280 nm的水中測(cè)量。假設(shè)所有對(duì)Cys殘基形成胱氨酸，外系數(shù)45 045 Abs 0.1%（=1 g/L）1.800，假設(shè)所有Cys殘基均減少，外系數(shù)44 920 Abs 0.1%（=1 g/L）1.795。理論等電點(diǎn)為6.65，脂肪指數(shù)為76.77，GRAVY為-0.133，不穩(wěn)定指數(shù)為58.20，半衰期為30 h，說(shuō)明Bcl-2為酸性不穩(wěn)定親水蛋白。

表2 牛Bcl-2氨基酸的組成

2.2.2 牛Bcl-2蛋白氨基酸序列同源性分析使用NCBI-BLAST進(jìn)行牛Bcl-2蛋白同源性比對(duì)。將牛Bcl-2蛋白與亞洲水牛（登錄號(hào)XP_020761266.1）、山羊（登錄號(hào)NP_001301142.1）、綿羊（登錄號(hào)XP_011959221.3）、白尾鹿（登錄號(hào)VFV45177.1）、西班牙猞猁（登錄號(hào)XP_032167375.1）、家貓（登錄號(hào)XP_023096959.1）、金錢(qián)豹（登錄號(hào)XP_019319377.1）、港海豹（登錄號(hào)XP_032278690.1）、白鼬（登錄號(hào)XP_025742125.1）、北海狗（登錄號(hào)XP_006064629.1）的Bcl-2蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，與亞洲水牛的蛋白序列同源性最高，達(dá)到99.56%。

圖5 Bcl-2氨基酸序列同源性預(yù)測(cè)

2.2.3 牛Bcl-2氨基酸分子的親水性、疏水性分析運(yùn)用在線(xiàn)工具ExPASy-ProtParam tool分析預(yù)測(cè)氨基酸與水結(jié)合的性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，牛Bcl-2蛋白在第96，97位氨基酸處有最小值，GRAVY值為-2.700，在第213，214位氨基酸處有最大值，GRAVY值為2.422，疏水性氨基酸明顯少于親水性氨基酸，說(shuō)明牛Bcl-2蛋白為親水性蛋白。

圖6 牛Bcl-2蛋白質(zhì)疏水性分析

2.2.4 牛Bcl-2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析運(yùn)用TMHMMServer v.2.0與SPLIT 4.0兩個(gè)工具對(duì)Bcl-2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的跨膜螺旋數(shù)量為1；跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值為21.922 9（n≥18），可能含跨膜螺旋或者含有信號(hào)肽，因此Bcl-2蛋白有跨膜區(qū)；Bcl-2蛋白的前60個(gè)氨基酸中跨膜螺旋的氨基酸量的期望值為0.000 79；Bcl-2蛋白的1～203位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)，204～225位氨基酸形成一個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，227～229位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，證明Bcl-2蛋白為跨膜蛋白。

圖7 牛Bcl-2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)SPLIT 4.0預(yù)測(cè)分析

2.2.5 牛Bcl-2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)根據(jù)SignalP 4.1 Server對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果表明：該條氨基酸序列沒(méi)有信號(hào)肽；牛Bcl-2蛋白C得分峰值位于第47，66，67位氨基酸，均為0.111；S得分峰值位于第55位氨基酸，為0.115；Y得分峰值位于第68位氨基酸，為0.107。根據(jù)上述預(yù)測(cè)結(jié)果判斷，Bcl-2蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白。

圖8 牛Bcl-2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖

2.2.6 牛Bcl-2蛋白分子亞細(xì)胞位點(diǎn)預(yù)測(cè)運(yùn)用在線(xiàn)工具PSORTⅡ進(jìn)行Bcl-2蛋白分子亞細(xì)胞位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，Bcl-2蛋白有26.15%分布于細(xì)胞質(zhì)，21.7%分布于分泌系統(tǒng)的囊泡、13.0%分布于核，13.0%分布于線(xiàn)粒體，8.7%分布于質(zhì)膜，4.3%分布于細(xì)胞骨架，4.3%分布于液泡，4.3%分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、4.3%分布于高爾基體。

表3 牛Bcl-2蛋白分子亞細(xì)胞位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 %

2.2.7 牛Bcl-2蛋白結(jié)構(gòu)域分析利用NCBI的CD-Search對(duì)Bcl-2蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖9。結(jié)果表明，Bcl-2蛋白有Bcl-2家族蛋白典型結(jié)構(gòu)域和BH1-BH3結(jié)合位點(diǎn)。

圖9 牛Bcl-2蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.2.8 牛Bcl-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析運(yùn)用在線(xiàn)工具PSIpred-MEMSAT 3對(duì)Bcl-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖10。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)Bcl-2蛋白由51.53%的α-螺旋、6.99%的β-轉(zhuǎn)角、6.55%的延伸鏈與34.93%的無(wú)規(guī)卷曲組成，有7個(gè)α-螺旋，6個(gè)β-轉(zhuǎn)角。

圖10 牛Bcl-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.9 牛Bcl-2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析運(yùn)用SWISS-MODEL工具按同源建模法構(gòu)建出Bcl-2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。對(duì)Bcl-2蛋白進(jìn)行同源建模和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)有3個(gè)模型，有2個(gè)模型描述為Bcl-2頡頏劑，1個(gè)模型為Bcl-2，見(jiàn)圖11。Bcl-2蛋白和模板1gjh.1.A進(jìn)行比較，GMQE為0.56，QMEAN為0.11，寡聚狀態(tài)為單體，無(wú)配體，生物單位低聚狀態(tài)為異二聚體，四級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)量估計(jì)（QSQE）為0.00，有92.39%的氨基酸序列一致，并且預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

圖11 牛Bcl-2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

1）本試驗(yàn)中，分析目標(biāo)基因組成，得出該核苷酸序列中C含量最高，A含量最少，DNA序列較穩(wěn)定。經(jīng)同源性分析該基因同系物，牛的直系同源是人類(lèi)與小鼠，同屬于哺乳動(dòng)物，具有高度保守性。與已公布的幾種動(dòng)物Bcl-2基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，得出牛與牦牛Bcl-2基因序列同源性最高，與其他品種牛也有較高的同源性；不同動(dòng)物Bcl-2蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)，測(cè)得與亞洲水牛的蛋白序列同源性最高。牦牛與牛同屬哺乳綱偶蹄目?？疲珜?duì)屬于牛屬還是牦牛屬未有定論，不過(guò)長(zhǎng)期以來(lái)中國(guó)用牦牛與普通牛進(jìn)行雜交，現(xiàn)存牦牛的起源和形成在一定程度上吸收了普通牛的基因，其他品種的牛也與普通牛有較近的親緣關(guān)系，所以Bcl-2基因具有高度保守性。

2）Bcl-2基因含有3個(gè)外顯子，經(jīng)剪切產(chǎn)生出2個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼Bcl-2a和Bcl-2β蛋白。本試驗(yàn)結(jié)果表明，牛Bcl-2基因可編碼229個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的可溶酸性蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為25 026.10 Da，含1個(gè)跨膜區(qū)，不含信號(hào)肽，非分泌蛋白，有3種三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測(cè)為跨膜性結(jié)構(gòu)蛋白。不穩(wěn)定性指數(shù)為58.20，將蛋白質(zhì)分類(lèi)為不穩(wěn)定，預(yù)測(cè)Bcl-2蛋白通過(guò)共價(jià)鍵的形成與斷裂產(chǎn)生不同的構(gòu)型，或是通過(guò)聚集、表面吸附等方式在雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡上有重要作用。賈浩等［16］通過(guò)蛋白穩(wěn)定常數(shù)（PSI）評(píng)價(jià)人類(lèi)胞內(nèi)蛋白壽命，結(jié)果表明，短半衰期的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)定位于細(xì)胞膜或膜性囊泡結(jié)構(gòu)上，與預(yù)測(cè)Bcl-2蛋白亞位點(diǎn)位置相同，但其半衰期偏長(zhǎng)，為30 h。Bcl-2基因可延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間且具備抗細(xì)胞凋亡的作用，在多種腫瘤中作為重要的凋亡抑制基因得到研究［17］，Bcl-2蛋白的半衰期可向減少方向研究以應(yīng)用于腫瘤治療方面。

3）根據(jù)程金娜等［18］的研究，Bcl-2家族的三維結(jié)構(gòu)主要為6～7個(gè)長(zhǎng)度不一的疏水性α-螺旋，有利于Bcl-2成員之間的疏水性接觸，促進(jìn)異源二聚化作用，這與本試驗(yàn)預(yù)測(cè)的Bcl-2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)似。牛Bcl-2蛋白的1～203位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)，此部分大多為親水性氨基酸；204～225位氨基酸之間形成一個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，227～229位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，此部分主要由疏水性氨基酸構(gòu)成，預(yù)測(cè)胞外疏水區(qū)結(jié)構(gòu)是反應(yīng)的主要區(qū)域，可能與接收胞外信號(hào)，使得跨膜區(qū)疏水區(qū)域發(fā)生改變來(lái)控制膜的通透性有關(guān)。研究表明，Bcl-2基因蛋白家族的結(jié)構(gòu)主要由位于羧基端的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane region，TM）和數(shù)量不等（1～4個(gè)）的Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（Bcl-2 homology，BH）兩大結(jié)構(gòu)域組成。BH-4作為抗凋亡蛋白特有的結(jié)構(gòu)域，缺失可導(dǎo)致抗凋亡蛋白功能的喪失，而被認(rèn)為是死亡結(jié)構(gòu)域的BH-3與促進(jìn)凋亡有關(guān)［19-21］。該結(jié)構(gòu)在家族成員的相互作用中起重要作用，Bcl-2蛋白可能通過(guò)疏水結(jié)構(gòu)域與促凋亡蛋白的BH-3結(jié)合起頡頏作用，且Bcl-2蛋白的BH-3結(jié)構(gòu)域與beclin1結(jié)合后形成復(fù)合物，降低脂質(zhì)激酶Vps34活性，抑制beclin 1介導(dǎo)自噬的功能［22］。

4）細(xì)胞凋亡主要通過(guò)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase途徑和組織結(jié)構(gòu)損傷兩種途徑將死亡信號(hào)下傳（downstream），后者以線(xiàn)粒體功能障礙為主要特征。根據(jù)Bcl-2蛋白分子亞細(xì)胞位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，除分布在細(xì)胞質(zhì)中，還主要分布于分泌系統(tǒng)的囊泡、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這些含有膜的細(xì)胞器上，以酸性親水的跨膜蛋白形式存在。預(yù)測(cè)其可能通過(guò)控制膜的通透性、維護(hù)線(xiàn)粒體的完整性以抑制細(xì)胞凋亡，或是在凋亡信號(hào)作用下改變構(gòu)型、異位并插入線(xiàn)粒體外膜發(fā)揮促凋亡活性［23-26］。吳開(kāi)年等［27］的研究表明，Bcl-2蛋白對(duì)線(xiàn)粒體外膜和內(nèi)膜的通透性進(jìn)行控制，抑制了細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的降低、細(xì)胞色素C和凋亡起始因子的釋放以及Caspase蛋白酶的激活，從而抑制凋亡。

以上研究結(jié)果為開(kāi)展牛Bcl-2基因和蛋白功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 致謝

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院黃璐佳碩士對(duì)研究給予了幫助，謹(jǐn)致謝意！