初產(chǎn)婦足月前胎膜早破與基質(zhì)金屬蛋白酶-7及OAS1基因多態(tài)性的關(guān)系

潘瑞琪，廖明星，江夢(mèng)曦，陳玲娟，艾承錦

0 引 言

妊娠37周(足月)前發(fā)生胎膜破裂稱作未足月胎膜早破(preterm prelabor rupture of membranes，PPROM)，約占所有早產(chǎn)比例的1/4，是導(dǎo)致圍產(chǎn)兒死亡的重要原因[1]。目前PPROM發(fā)病機(jī)理尚未闡明；以往多圍繞機(jī)械力學(xué)、感染及炎癥等因素展開(kāi)[2-3]。近年來(lái)越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外報(bào)道指出，遺傳因素在PPROM發(fā)生中關(guān)鍵作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，PPROM所致自發(fā)性早產(chǎn)存在明顯家族聚集性與種族差異性特點(diǎn)[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)屬鋅依賴性蛋白酶，系維持胎膜機(jī)械結(jié)構(gòu)的重要因子，在妊娠期間通過(guò)介導(dǎo)膠原蛋白分解、細(xì)胞外機(jī)制重塑等維持胎膜結(jié)構(gòu)完整性，同時(shí)可切割細(xì)胞外基質(zhì)底物，調(diào)控妊娠重塑、血管生成[7]。MMP-7位于11 q21-22染色體，屬M(fèi)MPs家族成員，可降解蛋白多糖、彈性蛋白及纖維連接蛋白等，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過(guò)程[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)MMP-7 rs1156818位點(diǎn)G等位基因啟動(dòng)子活性較A等位基因活性高，可引起MMP-7基因轉(zhuǎn)錄水平提升，介導(dǎo)炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程，與PPROM患病存在一定的關(guān)聯(lián)[9]。2′，5′-寡腺苷酸合成酶1(2′，5′ oligoadenylate synthetase 1，OAS1)屬干擾素誘導(dǎo)內(nèi)源性抗病毒蛋白，位于12號(hào)染色體，已證實(shí)與病毒感染性疾病發(fā)生密切相關(guān)[10]。而PPROM已證實(shí)與感染、炎癥及自身免疫因素有關(guān)[11]。OAS1基因多個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可影響OAS1蛋白酶抗病毒活性，導(dǎo)致核苷轉(zhuǎn)移酶活性轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，而rs10774671位點(diǎn)為OAS1基因功能性單核苷酸位點(diǎn)，系基因啟動(dòng)子最關(guān)鍵功能性單核苷酸多態(tài)性，屬第7外顯子剪切受體，直接決定mRNA的剪接，可通過(guò)影響剪接影響產(chǎn)物酶活性，與多種感染性疾病發(fā)病及轉(zhuǎn)歸存在一定的關(guān)聯(lián)[12]。因此，推測(cè)OAS1功能性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10774671基因多態(tài)性可能與PPROM遺傳易感性有關(guān)。為驗(yàn)證以上結(jié)論，本研究采集PPROM初產(chǎn)婦與正常足月妊娠初產(chǎn)婦MMP-7、OAS1基因多態(tài)性，以明確以上基因多態(tài)性與PPROM發(fā)生的關(guān)系，總結(jié)胎膜早破的分子生物學(xué)機(jī)制，以期為胎膜早破病因?qū)W研究提供證據(jù)，旨在為PPROM預(yù)防提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2018年5月-2019年7月82例PPROM初產(chǎn)婦(PPROM組)臨床資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：①初產(chǎn)婦；②單胎、頭位；③孕周明確；④符合參考文獻(xiàn)[13]中關(guān)于PPROM診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑤通過(guò)臨床表現(xiàn)(陰道胎脂樣液體流出或外陰異常濕潤(rùn))、超聲檢查(羊水量少)、羊膜鏡檢查(直視胎兒先露部，但無(wú)法直視前羊膜囊)、實(shí)驗(yàn)室檢查(胎兒纖連蛋白≥0.05 mg/L，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1陽(yáng)性)、陰道pH值(pH值>6.5)檢查等確診；⑥漢族；⑦無(wú)其他產(chǎn)科并發(fā)癥或內(nèi)外科合并癥；⑧陰道分娩或剖宮產(chǎn)(非擇期剖宮產(chǎn))；⑨臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①人為因素(人工破膜、應(yīng)用催產(chǎn)素等)所致PPROM；②骨盆畸形者；③原因不明發(fā)熱；④無(wú)吸煙飲酒史；⑤合并其他內(nèi)外科疾病。另按1∶1比例選取同期于醫(yī)院住院及分娩且年齡與之相仿的82例足月妊娠后分娩的初產(chǎn)婦作為對(duì)照。

1.2方法

1.2.1 標(biāo)本采集①臍血標(biāo)本：均于胎兒分娩后立即抽取臍帶血4 mL，枸櫞酸鈉抗凝后4℃低溫保存；②胎盤組織標(biāo)本：胎盤娩出5 min內(nèi)自近宮頸口胎膜破口處剪取約1 cm× 1 cm胎膜組織，無(wú)菌鹽水沖洗，含RNA保護(hù)液凍存管保存，采血1周內(nèi)提取DNA。

1.2.2基因型檢測(cè)采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction ，PCR)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymophism，RELP)法測(cè)定MMP-7、OAS1基因型及等位基因分布。采集胎膜組織標(biāo)本，參照美國(guó)Promega公司Trizol抽提試劑盒說(shuō)明提取總RNA，組織標(biāo)本加入少量液氮，快速研磨；組織變軟后再加入液氮，研磨，重復(fù)3次。按每50～100 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)加入Trizol，室溫放置4 min，充分裂解，以12 000×g離心力離心5 min，棄沉淀，加入200 μL氯仿，振蕩均勻，室溫放置15 min；84 ℃下以12 000×g離心力離心15 min，吸取上層水相，加入異丙醇混合均勻，室溫放置5～10 min，4 ℃ 8 000×g離心5 min，棄上清，干燥5～10 min，加入50 μL H2O(55～60℃)溶解RNA樣品5～10 min，Namedrop 2000c型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Sci公司)確定純度及濃度滿意后，1%瓊脂糖凝膠電泳(美國(guó)Bio-Rad公司YLN-200A型凝膠成像系統(tǒng))檢測(cè)DNA完整性，上GenBank查詢MMP-7基因、OAS1基因引物序列，Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因引物，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成。MMP-7基因(rs1156818位點(diǎn))引物序列：上游 5′-TGGTACCATAATGTCCTGAATG-3′，下游 5′-TCGTTATTGGCAGGAAGCACACAATGAATT-3′；OAS1基因(rs10774671位點(diǎn))引物序列：上游5′-TCGTCGGTCTCATCGTCTGTACTGTTGCTTTAAGC-3′，下游5′-CCCCTACGTGGATCACTGACT-3′。PCR儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，MMP-7 PCR反應(yīng)體系：DNA模板1.0 μL+10×buffer 2.5 μL+上下游引物各0.5 μL+dNTP10 mmol/L 0.5 μL+Taq-DNA聚合酶0.2 μL+雙蒸水補(bǔ)足至25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸5 min；OAS1 PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL+上下游引物各1.0 μL+2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL+雙蒸水水補(bǔ)足至25 μL，PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，12個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸12 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，20個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸12 min。均取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL加入上樣緩沖液2 μL混合均勻，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，45 min)，紫外分光光度計(jì)觀察并拍照確定擴(kuò)增成功，以滅菌去離子水作為陰性對(duì)照，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物參照PCR產(chǎn)物純化試劑盒(美國(guó)Sigma公司)進(jìn)行純化，取PCR產(chǎn)物10 μL(多次重復(fù)獲得穩(wěn)定PCR產(chǎn)物)，加入限制性內(nèi)切酶(美國(guó)R&D公司)10 U及10×buffer 1 μL，37 ℃水浴消化過(guò)夜，反應(yīng)終止后3%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型，MMP-7 rs1156818位點(diǎn)A等位基因無(wú)EcoR Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)，消化后仍為150 bp完整片段；G等位基因EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn)別切開(kāi)，消化后產(chǎn)物存在120 bp、30 bp兩條光帶；A/A純合基因型為150 bp基因片段，G/G純合型表現(xiàn)為120 bp、30 bp兩條光帶，G/A雜合基因型表現(xiàn)為150 bp、120 bp與30 bp三條光帶。OAS1 rs10774671位點(diǎn)A等位基因經(jīng)酶切后產(chǎn)物為264 bp與36 bp兩條光帶，G等位基因表現(xiàn)為300 bp一條光帶，每批PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均以蒸餾水替代DNA作為陰性對(duì)照，均重復(fù)檢測(cè)3次確定分型準(zhǔn)確性。

1.2.3臍血MMP-7、OAS1測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定臍血MMP-7表達(dá)(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)；放射免疫法測(cè)定OAS1表達(dá)(試劑盒購(gòu)自Eiken chemical公司)，臍帶血樣本1500 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行試驗(yàn)，嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明操作。美國(guó)Bio-Rad公司全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值(optical density，OD)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MMP-7濃度；OAS1以DFM-96型放射免疫γ計(jì)數(shù)器(合肥眾成機(jī)電技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)測(cè)定其濃度。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較PPROM組與對(duì)照組孕婦年齡、體重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PPROM組新生兒出生體重、新生兒出生1 min阿氏評(píng)分低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 未足月胎膜早破與足月初產(chǎn)婦一般資料比較Table 1 Comparison of general data between primiparas with PPROM and full-term primiparas

2.2基因組DNA電泳結(jié)果DNA樣品濃度范圍在85～100 ng/μL之間，A260/A280在1.85～1.95之間，濃度、純度均滿足試驗(yàn)要求，見(jiàn)表2。樣本均進(jìn)行1%瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)各條帶顯示清晰，樣品完整度好，滿足試驗(yàn)要求，PCR擴(kuò)增電泳發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物引物條帶清晰，與預(yù)計(jì)產(chǎn)物片段大小基本一致。

表2 部分基因組NDA濃度及純度測(cè)定結(jié)果Table 2 Concentrations and purity of NDA in some genomes

2.3基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布依據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，MMP-7基因 (rs1156818位點(diǎn))、OAS1基因(rs10774671位點(diǎn))基因型分布頻率均滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡要求(P>0.05)，表明群體代表性較高。PPROM組、對(duì)照組MMP-7基因rs1156818位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PPROM組攜帶AG型基因型所占比例高于對(duì)照組(P<0.05)，攜帶G型等位基因比例高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。PPROM組、對(duì)照組OAS1基因rs10774671位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表3 MMP-7基因 (rs1156818位點(diǎn))基因型及等位基因頻率分布[n(%)]Table 3 Distribution of genotype and allele frequencies onMMP-7 gene (rs1156818 locus) n(%)

表4 OAS1基因(rs10774671位點(diǎn))基因型及等位基因頻率分布[n(%)]Table 4 Distribution of genotype and allele frequencies on OAS1 gene (rs10774671 locus) n(%)

2.4臍血MMP-7、OAS1濃度比較兩組臍血OAS1濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PPROM組臍血MMP-7濃度高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 兩組臍血MMP-7、OAS1濃度比較Table 5 Comparison of the concentrations of MMP-7 and OAS1 in cord blood between the two groups

2.5MMP-7基因(rs1156818位點(diǎn))多態(tài)性分布與PPROM關(guān)系Logistic回歸分析顯示：攜帶AG基因型可能使PPROM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加2.128倍(校正OR=2.128,95%CI：1.623～2.788)；攜帶等位基因G可能使PPROM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加2.149倍(校正OR=2.149,95%CI：1.719～2.387)，見(jiàn)表6。

表6 MMP-7基因(rs1156818位點(diǎn))多態(tài)性分布與PPROM關(guān)系[n(%)]Table 6 Relationship between polymorphism distribution of MMP-7 gene (rs1156818 locus) and PPROM n(%)

3 討 論

胎膜系保護(hù)妊娠期間胎兒免受機(jī)械或物理因素影響的屏障，由胎膜細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中細(xì)胞外基質(zhì)均由細(xì)胞自身合成，分泌至細(xì)胞外，為各類細(xì)胞提供支點(diǎn)與附著點(diǎn)[14]。足月前胎膜早破并早產(chǎn)是影響圍產(chǎn)期新生兒預(yù)后的主要原因[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPROM組新生兒出生體重、出生1 min阿氏評(píng)分均較對(duì)照組低，推測(cè)PPROM與新生兒低出生體重及新生兒窒息等不良事件存在關(guān)聯(lián)。以往對(duì)PPROM的機(jī)制多圍繞感染、羊水過(guò)多、胎位、多胎及營(yíng)養(yǎng)因素等展開(kāi)[16-17]。但部分未暴露于以上因素內(nèi)孕婦仍可發(fā)生胎膜早破，提示除上述環(huán)境因素外，有其他因素參與PPROM發(fā)生過(guò)程[18]。近年來(lái)較多證據(jù)顯示，遺傳背景在PPROM發(fā)病中有關(guān)鍵作用[19-20]。流行病學(xué)資料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PPROM發(fā)生存在種族差異與家族聚集性。家族有早產(chǎn)史女性PPROM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較無(wú)家族史女性更高[21]。較多國(guó)外報(bào)道顯示，胎膜破裂過(guò)程中大量細(xì)胞外基質(zhì)被降解；而MMPs可廣泛切割細(xì)胞外基質(zhì)分子，可能在胎膜早破中發(fā)揮一定的作用[22-23]。

MMP-7為一類鋅依賴蛋白水解酶，屬降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞膠原細(xì)胞及結(jié)締組織細(xì)胞等分泌，可將基質(zhì)金屬蛋白酶原形式轉(zhuǎn)化為具活性基質(zhì)金屬蛋白酶，加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，破壞胎膜屏障[24]。MMP-7基因分子量較小，據(jù)報(bào)道，其啟動(dòng)子-181位點(diǎn)存在A/G基因多態(tài)性，認(rèn)為該位點(diǎn)A→G突變可提升該基因轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)MMP-7基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)MMP-7蛋白表達(dá)[25]。尹玲鳳等[26]發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)患者臍血、羊水、胎膜內(nèi)MMP-7濃度均明顯上調(diào)。張賜敏等[27]報(bào)道，MMP-7與腫瘤壞死因子-α等可通過(guò)協(xié)同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致胎膜早破發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，PPROM組胎膜組織MMP-7 基因rs1156818位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布與對(duì)照組正常足月產(chǎn)孕婦有明顯差別，PPROM組攜帶AG型基因型比例及G型等位基因比例高于對(duì)照組；同時(shí)Logsitic回歸分析發(fā)現(xiàn)，攜帶G等位基因女性較攜帶A等位基因女性PPROM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高約2倍，肯定了PPROM發(fā)病與MMP-7的關(guān)系，支撐侯國(guó)花等[28]研究結(jié)論，但更進(jìn)一步說(shuō)明MMP-7基因rs1156818位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布與PPROM易感性有關(guān)，提示與攜帶A型等位基因相比，攜帶G等位基因女性更易發(fā)生PPROM；提示G等位基因可能為PPROM易感基因。同時(shí)檢測(cè)臍血MMP-7濃度發(fā)現(xiàn)，PPROM組臍血MMP-7濃度水平明顯高于對(duì)照組，證實(shí)MMP-7可能與胎膜早破發(fā)生密切相關(guān)。分析機(jī)制可能為：MMP-7基因rs1156818位點(diǎn)A→G突變導(dǎo)致MMP-7轉(zhuǎn)錄活性上升，MMP-7蛋白釋放進(jìn)入血液，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解增多；同時(shí)其可降解促防御素、Fas-配體、上皮鈣附著蛋白等細(xì)胞因子，刺激細(xì)胞遷移，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，破壞胎膜防御屏障，影響胎膜組織代償性修復(fù)，增加胎膜早破發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

已證實(shí)宮內(nèi)或全身性感染與PPROM所致早產(chǎn)發(fā)生密切相關(guān)[29]。但最新報(bào)道發(fā)現(xiàn)，無(wú)論有無(wú)宮內(nèi)感染，促分泌炎性因子腫瘤壞死因子-α、IL-6等均可從絨毛膜、蛻膜分離，認(rèn)為感染僅為PPROM誘導(dǎo)因素而非必要條件[30]。OAS1系由I型干擾素誘導(dǎo)釋放的內(nèi)源性抗病毒蛋白，與病毒感染性疾病發(fā)生密切相關(guān)[31]。陳祿彪等[32]發(fā)現(xiàn)，肝炎病毒感染患者OAS1基因位點(diǎn)3′UTR區(qū)GG基因型所占比例較非肝炎低，認(rèn)為OAS1基因多態(tài)性與肝炎發(fā)生有關(guān)。但對(duì)OAS1基因多態(tài)性與PPROM的關(guān)系尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，PPROM組與對(duì)照組干擾素抗病毒蛋白OAS1 rs10774671位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率與對(duì)照組無(wú)顯著差異，兩者等位基因分布規(guī)律類似，同時(shí)兩組臍血OAS1濃度比較無(wú)明顯差異，故本研究認(rèn)為OAS1 rs10774671位點(diǎn)基因多態(tài)性與PPROM遺傳易感性無(wú)關(guān)，推測(cè)PPROM可能更傾向?yàn)闊o(wú)感染的炎癥性反應(yīng)引起，而宮內(nèi)感染并非PPROM發(fā)生的必要條件。但OAS1基因啟動(dòng)子區(qū)域含rs3741981、rs2285934、rs2660、rs1051042等單核苷酸多態(tài)性，均位于同一連鎖不平衡區(qū)域，與rs10774671共同調(diào)節(jié)細(xì)胞因子平衡，僅分析rs10774671位點(diǎn)基因多態(tài)性與PPROM的關(guān)系存在一定的局限[33]。后續(xù)需對(duì)OAS1基因啟動(dòng)子區(qū)域其他位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與PPROM的關(guān)系進(jìn)行研究，以明確OAS1基因與PPROM發(fā)病是否存在一定的關(guān)系。

綜上，MMP-7基因rs11568818位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能與初產(chǎn)婦PPROM易感性有關(guān)，攜帶等位基因G可能為PPROM發(fā)生的危險(xiǎn)因素；而OAS1基因rs10774671位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與PPROM易感性無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。但本研究所有對(duì)象均為漢族女性，日后需擴(kuò)大樣本量，研究MMP-7基因多態(tài)性與不同民族PPROM發(fā)生的關(guān)系，以期為不同地區(qū)PPROM預(yù)防提供指導(dǎo)。