RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體處方工藝優(yōu)化及體外抗腫瘤活性初步評(píng)價(jià)

張璐 何思雨 劉昕澤 孔亮 李學(xué)濤

中圖分類號(hào) R943;R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）10-1173-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.04

摘 要 目的：制備細(xì)胞穿膜肽RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體，并初步評(píng)價(jià)其體外抗腫瘤活性。方法：采用薄膜分散法制備RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體。以膽固醇加入量、紫杉醇加入量和探頭超聲時(shí)間間隔為考察因素，紫杉醇和五味子乙素兩藥的平均包封率為考察指標(biāo)，通過(guò)Box-Benhken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體的處方工藝，并對(duì)最優(yōu)處方工藝所制脂質(zhì)體進(jìn)行表征。采用磺酰羅丹明B染色法考察RPV修飾的空白脂質(zhì)體、紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體、RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的體外毒性作用，并采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分別考察上述3種脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果：最優(yōu)處方工藝為磷脂44 mg、膽固醇8 mg、紫杉醇0.64 mg、五味子乙素1.5 mg，探頭超聲時(shí)間間隔5 s，總處方量為5 mL。根據(jù)最優(yōu)處方工藝制得的脂質(zhì)體為類球形，粒徑為（126.49±1.19）nm，Zeta電位為（-4.83±0.61） mV，脂質(zhì)體中兩藥的平均包封率為（93.88±1.67）%。與RPV修飾的空白脂質(zhì)體比較，經(jīng)紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體、RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體處理后，SK-OV-3細(xì)胞的存活率、遷移抑制率和侵襲率均顯著降低（P<0.05），且RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體的作用優(yōu)于紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體（P<0.05）。結(jié)論：成功制備了RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體，且其具有一定的體外抗腫瘤活性。

關(guān)鍵詞 紫杉醇;五味子乙素;細(xì)胞穿膜肽;脂質(zhì)體;Box-Benhken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面實(shí)驗(yàn);處方工藝優(yōu)化;抗腫瘤活性;人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3

Prescription Technology Optimization of RPV Modified Paclitaxel and Schisandrin B Liposomes and Preliminary Evaluation of Antitumor Activity in vitro

ZHANG Lu，HE Siyu，LIU Xinze，KONG Liang，LI Xuetao（School of Pharmacy， Liaoning University of TCM， Liaoning Dalian 116600， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To prepare paclitaxel and schisandrin B liposomes modified by cell penetrating peptide RPV， and to preliminarily evaluate its anti-tumor activity in vitro. METHODS： RPV modified paclitaxel and schisandrin B liposomes were prepared by film dispersion method. Box-Benhken design-response surface methodology was used to optimize the prescription technology of RPV modified paclitaxel and schisandrin B liposomes using the amount of cholesterol and paclitaxel， the time interval of ultrasound probe as factors， average entrapment efficiency of paclitaxel and schisandrin B was used as the index. The liposomes prepared by the optimal technology were characterized. Sulfonylrhodamine B staining method was used to investigate in vitro toxicity of RPV modified blank liposomes， paclitaxel and schisandrin B liposomes， RPV modified paclitaxel and schisandrin B liposomes to human ovarian cancer cell SK-OV-3. The effects of 3 kinds of liposomes on the migration and invasion ability of SK-OV-3 cells were investigated by cell scratch test and Transwell chamber invasion test. RESULTS： The optimal prescription technology was phospholipid 44 mg， cholesterol 8 mg， paclitaxel 0.64 mg， schisandrin B 1.5 mg， ultrasonic probe time interval 5 s， prescription dosage 5 mL. According to the optimal prescription technology， the liposomes were spherical in shape， and the particle size was （126.49±1.19） nm， Zeta-potential was （-4.83±0.61） mV， average entrapment efficiency of liposomes was （93.88±1.67）%. Compared with RPV modified blank liposomes， after treated with paclitaxel and schisandrin B liposomes and RPV modified paclitaxel and schisandrin B liposomes， the survival rate， migration inhibition rate and invasion rate of SK-OV-3 cells were significantly decreased （P<0.05）. The effects of RPV modified paclitaxel and schisandrin B liposomes was better than those of paclitaxel and schisandrin B liposomes （P<0.05）. CONCLUSIONS： RPV modified paclitaxel and schisandra B liposome are successfully prepared， and they have certain antitumor activity in vitro.

KEYWORDS? ?Paclitaxel; Schisandrin B; Cell penetrating peptide; Liposome; Box-Benhken design-response surface methodology; Prescription technology optimization; Anti- tumor activity; SK-OV-3 cells

卵巢癌作為婦科生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，致死率較高，目前臨床上常采用紫杉醇相關(guān)制劑進(jìn)行治療[1]。紫杉醇是從紅豆杉樹皮中分離得到的一種二萜類生物堿，為一種廣譜抗癌藥，常用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌以及頭頸部癌等[2-5]。但紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性，在腫瘤部位的濃度較低、副作用較大，其臨床應(yīng)用受到了一定的限制[6-7]。五味子乙素作為中藥五味子的主要成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝等多種藥理活性，可通過(guò)抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-10]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，將五味子乙素與紫杉醇聯(lián)用后，五味子乙素可起到輔助作用，增強(qiáng)抗腫瘤藥物紫杉醇的活性并降低其副作用[11]。

脂質(zhì)體是由膽固醇和磷脂構(gòu)成的球型微囊結(jié)構(gòu)的藥物載體，在其表面修飾靶向配體后即能夠選擇性地將包埋的藥物濃集定位于靶組織、靶器官或靶細(xì)胞，且靶向脂質(zhì)體相比與普通脂質(zhì)體具有毒性低、靶向性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。細(xì)胞穿膜肽是一類由10～30個(gè)氨基酸殘基組成的能穿透細(xì)胞膜的短鏈多肽，其中富含堿性氨基酸，能夠與多種藥物分子結(jié)合并將藥物遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，以達(dá)到增強(qiáng)療效的目的，是一種有效的載體工具[14]。而RPV肽（氨基酸組成為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-纈氨酸-酪氨酸-亮氨酸-異亮氨酸）是一種新型的小分子細(xì)胞穿膜肽，與普通細(xì)胞穿膜肽相比，其能更好地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取[15]，為卵巢癌的治療帶來(lái)了新的希望。鑒于此，本研究擬制備一種RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體，并初步考察其對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用，為其后續(xù)抗卵巢癌研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器有HBS-1096A型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、FA1004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、T1-S型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SG3300H型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器公司）、JY92-2D型超聲波細(xì)胞搗碎機(jī)（寧波新芝生物股份有限公司）、20AT型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司）、JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）、ZS90型激光散射粒徑測(cè)定儀（英國(guó)Malvern公司）、WJ-80B-Ⅱ型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

紫杉醇對(duì)照品（批號(hào)J1101A，純度>99%）、膽固醇、磺酰羅丹明B均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)201805793，純度>99%）購(gòu)自湖州展舒生物科技有限公司;RPV（純度>95%）購(gòu)自上海吉爾生化有限公司;卵磷脂購(gòu)自日本NOF公司;胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司;MCCOYS 5A培養(yǎng)基、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)1022Q021）、葡聚糖凝膠Sephadex G-50（粒徑120 ?m）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法進(jìn)行制備。精密稱取處方量的RPV、卵磷脂、膽固醇和紫杉醇、五味子乙素對(duì)照品，加三氯甲烷5 mL，超聲（功率200 W，頻率40 kHz，下同）處理3 min，然后在40 ℃水浴中減壓蒸發(fā)除去三氯甲烷，使圓底燒瓶?jī)?nèi)壁形成一層薄膜。將得到的薄膜用PBS 5 mL超聲處理5 min使溶解，然后將此混懸液置于EP管中，以探頭超聲10 min后，用微孔濾膜（0.22 ?m）濾過(guò)2次，取濾液，即可得到RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體。除不加入紫杉醇和五味子乙素外，其余步驟同前，制備RPV修飾的空白脂質(zhì)體。除不加入RPV外，其余步驟同前，制備紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體。

2.2 紫杉醇含量測(cè)定方法的建立

采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水（42 ∶ 28 ∶ 30，V/V/V）;檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm;柱溫為30 ℃;流速為1 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液：稱取紫杉醇對(duì)照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品母液。以甲醇為溶劑，將上述對(duì)照品母液稀釋后制成質(zhì)量濃度分別為60、80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液：精密吸取RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體1 mL，加甲醇9 mL，混勻，超聲處理2 min破乳后，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（3）空白溶液：精密吸取RPV修飾的空白脂質(zhì)體1 mL，同供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，即得。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液（200 μg/mL）、空白溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，紫杉醇在6.5～6.6 min出峰，而空白溶液在對(duì)應(yīng)時(shí)間段無(wú)色譜峰出現(xiàn);待測(cè)成分峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，且主峰與雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，提示本方法專屬性良好，詳見圖1。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.2.2（1）”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得紫杉醇的回歸方程為y=22 946x-21 914（r=0.999 6）。結(jié)果表明，紫杉醇在60～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下2號(hào)方案樣品6份，分別按“2.2.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入“2.2.4”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算紫杉醇的含量。結(jié)果，紫杉醇的平均含量為202.10 μg/mL（RSD=0.18%，n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液（120 μg/mL）適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，紫杉醇峰面積的RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下2號(hào)方案樣品，按“2.2.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，紫杉醇峰面積的RSD為0.23%（n=6），表明該脂質(zhì)體供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下已知含量的樣品（2號(hào)方案樣品）6份，分別按“2.2.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按質(zhì)量比1 ∶ 1加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液適量，混勻，然后按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入“2.2.4”項(xiàng)下回歸方程中計(jì)算紫杉醇含量，并計(jì)算其加樣回收率。結(jié)果，測(cè)得紫杉醇的平均加樣回收率為102.16%（RSD=0.49%，n=6），詳見表1。

2.3 五味子乙素含量測(cè)定方法的建立

采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動(dòng)相為甲醇-水（85 ∶ 15，V/V）;檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm;柱溫為30 ℃;流速為1 mL/min;進(jìn)樣量為10 ?L。

2.3.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液：稱取五味子乙素對(duì)照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品母液。以甲醇為溶劑，將上述對(duì)照品母液進(jìn)行稀釋后制成質(zhì)量濃度分別為40、60、80、100、110、130、150 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液、空白溶液：分別按照“2.2.2（2）”“2.2.2（3）”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，即得。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液（150 μg/mL）、空白溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，五味子乙素在8.9～9.2 min處出峰，而空白溶液在此時(shí)間段無(wú)色譜峰出現(xiàn);待測(cè)成分峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，且主峰與雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，提示本方法的專屬性良好，詳見圖2。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.3.2（1）”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度系列對(duì)照品溶液各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得到五味子乙素的回歸方程為y=17 754x-73 726（r=0.999 6）。結(jié)果表明，五味子乙素在40～150 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積的線性關(guān)系良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下2號(hào)方案樣品6份，按“2.3.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后再按“2.3.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并將其代入“2.3.4”項(xiàng)下回歸方程中計(jì)算五味子乙素含量。結(jié)果，五味子乙素的平均含量為130.43 μg/mL（RSD=1.91%，n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液（80 μg/mL）適量，按“2.3.1“項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，五味子乙素峰面積的RSD為0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下2號(hào)方案樣品適量，按“2.3.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，五味子乙素峰面積的RSD為0.10%（n=6），表明該脂質(zhì)體供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下已知含量的樣品（2號(hào)方案樣品）6份，按“2.2.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后按質(zhì)量比1 ∶ 1加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，混勻，然后按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入“2.3.4”項(xiàng)回歸方程中計(jì)算出五味子乙素的含量，并計(jì)算其加樣回收率。結(jié)果，五味子乙素的平均加樣回收率為101.34%（RSD=0.15%，n=6），提示本方法的準(zhǔn)確度較好，詳見表1。

2.4 包封率的測(cè)定

取脂質(zhì)體樣品2 mL，逐滴加至Sephadex G-50凝膠柱中，用PBS洗脫，流速為1 mL/min，收集洗脫液乳光部分，并以PBS定容至2 mL。分別精密吸取未經(jīng)洗脫的脂質(zhì)體與洗脫后的脂質(zhì)體1 mL，加入甲醇9 mL破乳，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液。將脂質(zhì)體溶液與續(xù)濾液分別注入HPLC儀中，分別按照“2.2.1”“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定2種成分的峰面積后，代入“2.3.4”項(xiàng)下回歸方程中計(jì)算藥物含量，并計(jì)算其包封率：包封率（%）=Na/Nb×100%（式中，Na表示續(xù)濾液中藥物含量，Nb表示脂質(zhì)體溶液中藥物含量）。

2.5 脂質(zhì)體處方工藝的優(yōu)選

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)及文獻(xiàn)[16]，固定處方量為5 mL、磷脂為44 mg、紫杉醇和五味子乙素摩爾比為1 ∶ 5，初步選定對(duì)脂質(zhì)體制備過(guò)程影響相對(duì)較大的膽固醇含量（A）、紫杉醇含量（B）與探頭超聲時(shí)間間隔（簡(jiǎn)稱“時(shí)間間隔”，C）作為考察因素，兩藥平均包封率（Y，%）作為考察指標(biāo)，采用Box-Benhken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)選脂質(zhì)體的處方工藝。各因素水平編碼見表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

將表3中平均包封率數(shù)據(jù)輸入Design-Expert 8.0.6.1軟件中，擬合得到方程為Y=94.08+5.87A+4.16B+1.90C+0.90AB+1.03AC-1.83BC-20.92A2-5.55B2-1.38C2（R=0.991 8，P<0.05）。擬合結(jié)果表明，該模型可以較好地反映Y值的變化，可用以優(yōu)選RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體的最優(yōu)處方工藝。對(duì)擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A、B、C、A2、B2對(duì)Y值有顯著影響（P<0.01），因素AB、AC、BC、C2對(duì)Y值沒(méi)有顯著影響（P>0.05）;3個(gè)因素對(duì)平均包封率影響的大小順序?yàn)锳>B>C，即膽固醇質(zhì)量>紫杉醇質(zhì)量>時(shí)間間隔。使用Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制因變量和自變量的三維效應(yīng)面圖和二維等高圖，結(jié)果見圖3、圖4。

由圖3、圖4可知，C對(duì)Y值的影響不大，A和B對(duì)Y值則影響顯著。上述交互因素中A與B、A與C的效應(yīng)面形狀均較陡，等高線均呈明顯的橢圓形，而B與C的效應(yīng)面較平緩，等高線橢圓形不明顯，說(shuō)明A與B、A與C的交互作用更為明顯。該模型模擬所得最優(yōu)處方工藝為膽固醇8.32 mg、紫杉醇0.66 mg、超聲時(shí)間間隔4.55 s;根據(jù)該結(jié)果再結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室脂質(zhì)體處方考察經(jīng)驗(yàn)，確定最終的處方工藝為磷脂44 mg、膽固醇8 mg、紫杉醇0.64 mg、五味子乙素1.5 mg、處方量5 mL、超聲時(shí)間間隔5 s。

根據(jù)上述最優(yōu)處方工藝制備3批RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體，按前文所建HPLC法測(cè)定脂質(zhì)體中紫杉醇和五味子乙素的含量，并計(jì)算兩藥的平均包封率。結(jié)果，3批樣品中兩藥的平均包封率為（93.88±1.57）%，與模型預(yù)測(cè)值（95.70%）的相對(duì)誤差為1.89%。以上結(jié)果表明，本研究?jī)?yōu)選的處方工藝穩(wěn)定、可行。

2.6 脂質(zhì)體的表征

吸取按最優(yōu)工藝制備的脂質(zhì)體溶液適量，以PBS稀釋50倍。取稀釋后的脂質(zhì)體溶液適量，滴加至專用銅網(wǎng)上，以2%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干，然后置于透射電子顯微鏡上（透射電鏡加速電壓為120 kV）觀察其形態(tài)，平行操作3次。另取脂質(zhì)體溶液200 μL，使用激光散射粒徑測(cè)定儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑及Zeta電位（每次設(shè)定循環(huán)測(cè)10次），平行操作3次。結(jié)果顯示，RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體呈球形，粒徑為（126.49±1.19）nm（n=3），Zeta電位為（-4.83±0.61）mV（n=3）。 RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體的透射電鏡圖見圖5。

2.7 RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體體外抗腫瘤作用的初步評(píng)價(jià)

2.7.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 將SK-OV-3細(xì)胞接種于含10%FBS和1%青-鏈霉素的MCCOYS 5A完全培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）中，然后將其置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為90%后，棄去培養(yǎng)液，加入適量PBS清洗細(xì)胞，再加入0.25%胰蛋白酶1 500 μL消化細(xì)胞，然后用移液槍輕輕吹打使細(xì)胞完全脫落，將細(xì)胞懸液置于15 mL離心管中，以1 500 r/min離心3 min，吸棄上清液，重新加入新鮮的完全培養(yǎng)基重懸并轉(zhuǎn)移至2個(gè)新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本研究所用為傳代5～8代的細(xì)胞。

2.7.2 RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞存活率的影響 采用磺酰羅丹明B染色法進(jìn)行考察。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SK-OV-3細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基稀釋制成密度為1.0×105 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔1.5×104個(gè)接種于96孔板中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后將細(xì)胞分為稀釋不同倍數(shù)（分別稀釋為最優(yōu)處方工藝最大量的4/5、8/15、1/3、1/5、1/15、1/30，濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置）的RPV修飾的空白脂質(zhì)體組、紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組和RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。加藥后繼續(xù)孵育48 h，吸棄培養(yǎng)液，細(xì)胞用10%三氯乙酸溶液在4 ℃條件下固定1 h，用水沖洗3次。待孔板內(nèi)完全干燥后，每孔加0.4%磺酰羅丹明B溶液150 μL染色30 min，用1%乙酸溶液沖洗4次;室溫干燥后，每孔加入10 mmol/L的Tris堿溶液（pH 10.5）200 μL，振蕩1 h加速染料的溶解，然后使用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=ODn/OD0×100%（式中，ODn為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值，OD0為RPV修飾的空白脂質(zhì)體組細(xì)胞的OD值）。使用Graphpad-prism-5軟件計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組細(xì)胞存活率的測(cè)定結(jié)果見圖6。

結(jié)果顯示，RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的毒性最強(qiáng)[細(xì)胞存活率最低，IC50為（2.93±0.56） μmol/L]，其次為紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體[IC50為（4.21±0.43） μmol/L]，RPV修飾的空白脂質(zhì)體幾乎沒(méi)有毒性。與紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組比較，RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組的IC50顯著降低（P<0.05）。以上結(jié)果提示，RPV的修飾使脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用較普通脂質(zhì)體有所增強(qiáng)。

2.7.3 RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞遷移能力的影響 采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SK-OV-3細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基稀釋制成密度為1×105 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)接種于6孔板中，然后將其分為RPV修飾的空白脂質(zhì)體組、紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組和RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合度達(dá)到80%后，用10 μL槍頭在每孔中間畫3條平行線。以PBS沖洗掉劃痕中間死亡的細(xì)胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，并分別加入相應(yīng)脂質(zhì)體各200 μL（將處方稀釋5倍，即脂質(zhì)體中紫杉醇濃度為3 μmol/L，紫杉醇與五味子乙素摩爾比為1 ∶ 5，濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。分別于給藥培養(yǎng)0、24 h時(shí)拍照，用Image J 1.48軟件測(cè)定劃痕區(qū)域面積，并計(jì)算細(xì)胞遷移抑制率：遷移抑制率（%）=（1-S24 h/S0 h）×100%（式中，S24 h為給藥24 h時(shí)的劃痕面積，S0 h為給藥0 h時(shí)的劃痕面積）。按“2.7.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組細(xì)胞的劃痕面積測(cè)定結(jié)果見圖7。

結(jié)果顯示，3種脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞遷移能力的抑制作用大小為RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體>紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體>RPV修飾的空白脂質(zhì)體。與RPV修飾的空白脂質(zhì)體組[細(xì)胞遷移抑制率為（1.12±0.14）%]比較，紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組、RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組的細(xì)胞遷移抑制率[分別為（15.79±1.28）%、（86.41±2.05）%]均顯著升高（P<0.05）;且RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組細(xì)胞的遷移抑制率顯著高于紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組（P<0.05）。

2.7.4 RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞侵襲能力的影響 采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SK-OV-3細(xì)胞，以無(wú)血清的MCCOYS 5A培養(yǎng)液稀釋制成密度為3×104 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔1.5×104個(gè)接種于Transwell小室的上室中。于上室中分別加入RPV修飾的空白脂質(zhì)體、紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體及RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體各20 μL（脂質(zhì)體中紫杉醇濃度為15 μmol/L，紫杉醇與五味子乙素摩爾比1 ∶ 5，濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定），下室中加入完全培養(yǎng)基0.6 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。然后用PBS輕洗小室中未穿過(guò)下室的細(xì)胞，小室外側(cè)用4%多聚甲醛溶液固定30 min后，再置于0.1%結(jié)晶紫溶液中染色20 min。用PBS洗去多余染料后晾干，于倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照，計(jì)算細(xì)胞侵襲率：細(xì)胞侵襲率（%）=n/n0×100%（式中，n為給藥組侵襲細(xì)胞總數(shù)、n0為RPV修飾的空白脂質(zhì)體組侵襲細(xì)胞數(shù)）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按“2.7.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組細(xì)胞侵襲能力測(cè)定的顯微圖見圖8。

結(jié)果顯示，3種脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞侵襲能力的抑制作用大小為RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體>紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體>RPV修飾的空白脂質(zhì)體。與RPV修飾的空白脂質(zhì)體組[細(xì)胞侵襲率為（106.00±5.57）%]比較，紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組和RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組細(xì)胞的侵襲率[分別為（26.44±3.93）%、（9.21±1.77）%]均顯著降低（P<0.05），且RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體組細(xì)胞的侵襲率顯著低于五味子乙素脂質(zhì)體組（P<0.05）。

3 討論

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、診斷遲，因此其病死率位居?jì)D科癌癥首位[17]。目前，臨床上主要采取手術(shù)和放、化療等手段進(jìn)行治療，雖然可以改善患者的癥狀，但化療藥物本身的毒副作用對(duì)患者影響較大，故臨床應(yīng)用受限[18]。靶向治療是繼手術(shù)和放、化療后的一種新方法，能選擇性地作用于特定因子、酶類以及信號(hào)通路等，從而抑制癌細(xì)胞的增殖甚至直接殺死癌細(xì)胞[19]。靶向治療的機(jī)制主要是抑制腫瘤血管生成、抑制信號(hào)酶?jìng)鲗?dǎo)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[20]。紫杉醇作為臨床上常用的廣譜抗癌藥，在水溶液中的溶解度極低，口服給藥生物利用度較差，也不具備靶向性，臨床效果有限[21]。本研究成功制備了RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體，將紫杉醇和五味子乙素成功包載于脂質(zhì)體中，其中五味子乙素可發(fā)揮輔助作用，進(jìn)而增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤作用;穿膜肽RPV的修飾可進(jìn)一步增強(qiáng)脂質(zhì)體的靶向性，提高2種藥物在腫瘤部位的濃度，以達(dá)到更好的療效。因紫杉醇與五味子乙素在該脂質(zhì)體中具有協(xié)同抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，二者相輔相成[22]，故本研究對(duì)兩藥的平均包封率進(jìn)行考察。

處方工藝優(yōu)選的方法有單純形網(wǎng)格法、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法及正交設(shè)計(jì)法等，其中Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、預(yù)測(cè)值精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，能簡(jiǎn)單快速地優(yōu)化出最優(yōu)處方工藝[23-24]。本研究前期進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，以包封率為指標(biāo)，對(duì)膽固醇含量、紫杉醇含量、探頭超聲時(shí)間間隔和溫度進(jìn)行了考察，確定了各因素的重要程度及優(yōu)化區(qū)間，為本研究的Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法奠定了基礎(chǔ)。在本研究中，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選出的處方工藝為磷脂44 mg、膽固醇8 mg、紫杉醇0.64 mg、五味子乙素1.5 mg、處方量5 mL、超聲時(shí)間間隔5 s。在按上述處方工藝制備的脂質(zhì)體中，兩藥的平均包封率為（93.88±1.67）%，符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）對(duì)微粒制劑包封率不低于80%的要求[25]。接著，筆者對(duì)最優(yōu)處方工藝制備的脂質(zhì)體進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)該脂質(zhì)體呈球形，電位值略負(fù)，這可能與穿膜肽RPV的修飾有關(guān)[15]。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的毒性較強(qiáng)，能有效地抑制SK-OV-3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，且作用由優(yōu)于普通脂質(zhì)體。

綜上所述，本研究成功制備了包封率較高的RPV修飾的紫杉醇與五味子乙素脂質(zhì)體，并初步確定了其體外抗卵巢癌作用，為卵巢癌的治療帶來(lái)新的希望，但后續(xù)需要進(jìn)一步開展更為深入的細(xì)胞水平研究以及動(dòng)物體內(nèi)分析以對(duì)本結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 秦佳睿，尹香花.復(fù)發(fā)性卵巢癌治療方法的研究進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2021，7（2）：191-194.

[ 2 ] 劉先芳，梁敬鈺，孫建博.紫杉醇：具有里程碑意義的天然抗癌藥物[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2017，19（6）：941-949.

[ 3 ] 馮巧惠，李瓊，賀延苓，等.紫杉醇對(duì)卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌的抗癌功效及生物分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2020，27（3）：278-280.

[ 4 ] 郭年鳳.紫杉醇新劑型研究進(jìn)展[J].中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥，2019，26（24）：87-88.

[ 5 ] 屈怡帆，白莉.紫杉醇聯(lián)合順鉑一線治療晚期食管癌療效及預(yù)后分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25（15）：2405-2409.

[ 6 ] 于瑩，任耘.紫杉醇臨床應(yīng)用及安全性研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2017，29（2）：54-57.

[ 7 ] BERNABEU E，CAGEL M，LAGOMARSINO E，et al. Paclitaxel：what has been done and the challenges remain ahead[J]. Int J Pharm，2017，526（1/2）：474-495.

[ 8 ] 潘瑤，林劍霞，李妍.五味子乙素的藥理作用研究概況[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36（1）：60-62.

[ 9 ] 白文宇，王厚恩，王冰瑤，等.五味子化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中成藥，2019，41（9）：2177-2183.

[10] 趙煒，趙志正.五味子乙素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和Notch-1信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（10）：55-59.

[11] 陳冠男，耿麗晶，王筱瑜，等.五味子乙素對(duì)紫杉醇治療乳腺癌的減毒增效機(jī)制研究[J].中藥材，2019，42（5）：1156-1159.

[12] 楊貴蘭，李文軍，王春華.靶向脂質(zhì)體的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究，2020，39（5）：289-293、307.

[13] 楊治中，王梓亭，魏鵬.刺激響應(yīng)型脂質(zhì)體在靶向藥物遞送系統(tǒng)中應(yīng)用[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2020，36（12）：1395-1403.

[14] 梅雋彥.基于細(xì)胞穿膜肽的藥物遞送研究進(jìn)展[J].廣州化學(xué)，2020，45（2）：64-75.

[15] KONG L，CAI F Y，YAO X M，et al. RPV-modified epirubicin and dioscin co-delivery liposomes suppress non- small cell lung cancer growth by limiting nutrition supply[J]. Cancer Sci，2020，111（2）：621-636.

[16] 姚雪敏，荊鳴，蔡馥伊，等.穿膜肽GGPFV修飾的柔紅霉素/薯蕷皂苷脂質(zhì)體的處方優(yōu)化及細(xì)胞毒性研究[J].中國(guó)藥房，2020，31（21）：2579-2584.

[17] 郭坤蕾，張國(guó)楠.卵巢癌靶向治療的研究現(xiàn)狀[J].腫瘤預(yù)防與治療，2018，31（6）：449-454.

[18] 牛星燕，張冬萍，彭蕓花.卵巢癌鉑耐藥機(jī)制及相關(guān)靶向治療研究進(jìn)展[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志，2020，21（6）：661-663.

[19] 李溪，俞超芹.靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞治療卵巢癌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤，2019，28（2）：137-142.

[20] 晁宏圖，張孟麗. LncRNA LINC01138靶向miR-193a-3p對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2020，55（5）：668-672.

[21] 楊越.長(zhǎng)效靶向紫杉醇脂質(zhì)體的制備及其抗腫瘤作用研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2016.

[22] 張傳琪.五味子脂A通過(guò)抑制ROS增強(qiáng)紫杉醇抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2015.

[23] 袁思文，劉育辰，劉剛，等.單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化甘草中黃酮類成分的提取工藝[J].中國(guó)藥房，2019，30（3）：355-359.

[24] 曾海蓉，李婷娜，冉倩，等.基于熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化桂枝芍藥知母顆粒復(fù)方提取工藝[J].中草藥，2020，51（1）：84-90.

[25] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：474-476.

（收稿日期：2020-12-15 修回日期：2021-03-03）

（編輯：林 靜）