超聲技術(shù)抑制微生物生物膜污染：機(jī)制、影響因素及其在肉及肉制品中的應(yīng)用

張婧男 劉昊天 陳倩 孔保華

摘 要：由微生物生物膜污染所造成的疾病爆發(fā)會(huì)導(dǎo)致重大公共衛(wèi)生問題發(fā)生。為抑制生物膜污染，食品工業(yè)目前廣泛應(yīng)用的方法包括熱處理、添加化學(xué)殺菌劑等傳統(tǒng)方法。但是熱處理會(huì)導(dǎo)致肉及肉制品等食品的營養(yǎng)物質(zhì)流失，并破壞產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味特性，而化學(xué)殺菌劑的添加不符合當(dāng)前安全健康的消費(fèi)理念。此外，生物膜特有的結(jié)構(gòu)和功能特性賦予其抵抗環(huán)境脅迫的能力，因而對(duì)大多數(shù)化學(xué)殺菌劑具有一定的抗性。因此，尋找安全、高效的抑制生物膜手段是目前食品行業(yè)亟待解決的問題。超聲技術(shù)作為一種非熱處理方法用于抑制生物膜污染越來越受到關(guān)注。與傳統(tǒng)的殺菌技術(shù)相比，超聲技術(shù)不僅具有操作簡便、節(jié)約能源和延長食品貨架期等特點(diǎn)，并且在保持食品感官、功能特性及營養(yǎng)價(jià)值方面起到了非常重要的作用。本文綜述生物膜形成的機(jī)制、代謝過程及影響因素，并且對(duì)超聲技術(shù)進(jìn)行概述，在此基礎(chǔ)上介紹了超聲技術(shù)抑制微生物生物膜污染機(jī)制及影響因素，最后討論了超聲技術(shù)在肉及肉制品中的應(yīng)用和對(duì)未來的展望。

關(guān)鍵詞：超聲技術(shù);超聲抑菌機(jī)制;微生物生物膜;抑菌作用;肉及肉制品

Inhibition of Microbial Biofilm Contamination by Ultrasonic Technology： Mechanism， Influential Factors and Application to Meat and Meat Products

ZHANG Jingnan， LIU Haotian， CHEN Qian， KONG Baohua*

（College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

Abstract： Disease outbreaks caused by microbial biofilm contamination can cause major public health problems. The traditional methods such as heat treatment and addition of chemical bactericides are currently widely used to inhibit biofilm contamination in the food industry. However， heat treatment will cause the loss of nutrients in foods such as meat and meat products， and will destroy the texture and flavor characteristics of the products. Addition of chemical fungicides does not conform to the current safe and healthy consumption concept. In addition， the unique structural and functional properties of biofilms enable it to resist environmental stress and thus to most chemical bactericides. Therefore， finding a safe and efficient method to inhibit biofilm is an urgent problem in the food industry. The application of ultrasound technology as a non-heat treatment method for inhibiting biofilm pollution has attracted more and more attention. Compared with the traditional sterilization technology， ultrasonic technology not only has the advantages of simple operation， energy saving and extending food shelf life， but also plays a very important role in maintaining the sensory characteristics， functional characteristics and nutritional value of foods. This article reviews the mechanism， metabolic process and influential factors of biofilm formation， and provides an overview of ultrasound technology. Furthermore， the mechanism and influential factors of inhibit the inhibition of microbial biofilm contamination by ultrasound technology are described. Finally， the recent application of ultrasound technology in meat and meat products and future prospects are discussed.

Keywords： ultrasonic technology; ultrasonic sterilization mechanism; microbial biofilm; bactericidal effect; meat and meat products

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210315-072

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）05-0050-10

引文格式：

張婧男， 劉昊天， 陳倩， 等. 超聲技術(shù)抑制微生物生物膜污染：機(jī)制、影響因素及其在肉及肉制品中的應(yīng)用[J]. 肉類

研究， 2021， 35（5）： 50-59. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210315-072.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Jingnan， LIU Haotian， CHEN Qian， et al. Inhibition of microbial biofilm contamination by ultrasonic technology： mechanism， influential factors and application to meat and meat products[J]. Meat Research， 2021， 35（5）： 50-59. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210315-072.? ? http：//www.rlyj.net.cn

長期以來，食源性疾病的爆發(fā)在世界范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注。在過去的幾十年中，為了抑制微生物生物膜污染對(duì)食品品質(zhì)特性和貨架期的影響，仍然廣泛使用傳統(tǒng)的熱處理殺菌方式，如高溫?zé)崽幚韀1]和巴氏殺菌[2]等。然而，這些方法存在一定程度的加工缺陷，例如，過高溫度會(huì)導(dǎo)致肉中蛋白質(zhì)的聚集及降解，不利于蛋白質(zhì)消化，并會(huì)造成營養(yǎng)流失，其次對(duì)產(chǎn)品的色澤、滋味和口感等也會(huì)造成不良影響，并且熱處理會(huì)消耗大量能量，導(dǎo)致成本上升[3]。除了熱殺菌，化學(xué)殺菌劑的使用在食品行業(yè)中也比較常見，如氯處理[4]和有機(jī)酸[5]等。但是，大多數(shù)常規(guī)的化學(xué)殺菌劑在使用過程中常常會(huì)產(chǎn)生交叉抗性，對(duì)環(huán)境脅迫不敏感，除此之外，在食品加工過程中使用還會(huì)產(chǎn)生一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。

生物膜是一種由微生物所構(gòu)成的有結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群落，被包圍在由細(xì)胞外聚合物質(zhì)（extracellular polymeric substances，EPS）自身所構(gòu)成的基質(zhì)中，通常它們之間會(huì)彼此黏附或者附著于不同的界面或表面上。生物膜是許多微生物生存的一種模式，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下很容易形成，因此，生物膜實(shí)質(zhì)上會(huì)對(duì)微生物起到一定的“屏障”作用，從而使存在于其內(nèi)部的微生物對(duì)外部化學(xué)和物理作用產(chǎn)生一定程度的耐受。能夠產(chǎn)生生物膜的微生物在遭受到化學(xué)殺菌劑等處理的過程中，其所產(chǎn)生的抵抗力和耐受性都高于以浮游狀態(tài)存在的微生物，這是由于生物膜的存在使化學(xué)殺菌劑難以滲透和擴(kuò)散到其內(nèi)部，失去了使微生物失活的必要條件。García-Sánchez等[6]

證明一些能夠產(chǎn)生生物膜的空腸彎曲桿菌菌株可以在惡劣環(huán)境下存活，并且對(duì)常用抑菌劑均有較高的耐藥性。在肉制品及其他食品生產(chǎn)過程中，生物膜也會(huì)導(dǎo)致沖洗和擦拭等方法無法有效去除設(shè)備表面附著的微生物。

由于傳統(tǒng)的物理或化學(xué)殺菌方法存在殺菌不徹底和食用安全性等方面的問題，因此，有必要探索新型殺菌技術(shù)，以期能在一定程度保持品質(zhì)的前提下達(dá)到有效殺菌的目的。目前，主要的新型殺菌技術(shù)包括冷等離子體[7]、超臨界二氧化碳處理[8]和超聲技術(shù)[9]等，其中超聲技術(shù)作為一種食品非熱加工技術(shù)，在食品中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。近年來，通過超聲空化作用所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)破壞生物膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制微生物活性已成為食品殺菌技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但是關(guān)于超聲在肉及肉制品加工行業(yè)中的應(yīng)用報(bào)道并不多見。本文綜述微生物生物膜的形成和代謝過程;對(duì)超聲技術(shù)的分類、原理和技術(shù)特點(diǎn)進(jìn)行簡單介紹;同時(shí)對(duì)超聲技術(shù)抑制生物膜污染的具體誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)闡述，并對(duì)現(xiàn)有的國內(nèi)外研究進(jìn)行總結(jié)，以期為超聲技術(shù)在肉及肉制品等食品殺菌領(lǐng)域中的應(yīng)用提供借鑒。

1 微生物生物膜的形成機(jī)制、代謝過程及影響因素

生物膜是指由EPS所包圍的有結(jié)構(gòu)的微生物細(xì)胞群落，這些細(xì)胞群落在界面或表面上相互附著從而形成生物膜[10]。EPS是一種微生物來源的有機(jī)聚合物，在生物膜系統(tǒng)中起到聚合和黏附作用，并且在一定程度上決定了生物膜的結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度和性能，其主要成分包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)等[11]。導(dǎo)致人類食源性疾病爆發(fā)的常見微生物通常以生物膜形式存在，與浮游生物通過運(yùn)動(dòng)并定居于新的表面不同，生物膜細(xì)菌具有更加活躍的繁殖代謝能力以及較強(qiáng)的致病性。由于其生長并包埋在高度水合的陰離子基質(zhì)中，并且基質(zhì)聚合物和生物膜中最遠(yuǎn)端細(xì)胞上的大量帶電結(jié)合位點(diǎn)為內(nèi)部細(xì)胞提供保護(hù)，使其對(duì)抗菌劑有更強(qiáng)的抵抗力[12]。Alonso-Calleja等[13]研究證明，大腸桿菌ATCC12806生物膜不僅表現(xiàn)出對(duì)亞硝酸鈉和次氯酸鈉的單獨(dú)耐受性，還觀察到對(duì)其產(chǎn)生的交叉抗性，同時(shí)得出結(jié)論，能夠抑制浮游態(tài)微生物污染的食品級(jí)抗菌劑濃度已經(jīng)無法抑制大腸桿菌ATCC12806生物膜污染過程，并且為了避免其暴露于亞致死濃度抗菌劑后產(chǎn)生交叉耐受，需要提高抗菌劑濃度，但這會(huì)造成一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。

生物膜的形成主要包括5 個(gè)階段，第1階段為浮游微生物細(xì)胞的可逆附著，在初始階段，浮游微生物通過弱相互作用（如范德華力、疏水力和靜電力等）或鞭毛、菌毛和凝集素黏附等機(jī)制在非生物或生物表面可逆附著和生長繁殖，并且不斷地從液體環(huán)境中吸收營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)浮游生物的特征和活動(dòng)狀態(tài)以及附近流體相的擴(kuò)散和剪切力作用，附著類型可分為主動(dòng)附著和被動(dòng)附著[14]。

附著能力很大程度上取決于微生物的種類、濃度、體積、接觸時(shí)間和表面的物理化學(xué)性質(zhì)（表面電荷、pH值和溫度）等。在此階段中，只產(chǎn)生少量的EPS，大多數(shù)微生物仍然具備獨(dú)立運(yùn)動(dòng)的能力，甚至可以從表面分離并恢復(fù)浮游狀態(tài)。第2階段為產(chǎn)生EPS的不可逆附著階段，此階段微生物不斷增殖，EPS持續(xù)累積，從而逐漸轉(zhuǎn)變成不可逆附著狀態(tài)。通常，EPS的構(gòu)成與生物體類別和環(huán)境變化有關(guān)，一般由多糖、蛋白質(zhì)、糖蛋白、糖脂以及胞外DNA、金屬離子、二價(jià)陽離子和其他表面活性成分組成[15]。當(dāng)微生物分泌物達(dá)到一個(gè)臨界濃度時(shí)，利用其自身的多糖、鞭毛和菌毛等附著結(jié)構(gòu)相互結(jié)合成細(xì)菌聚集物并且在表面形成EPS，從而保護(hù)內(nèi)部細(xì)胞免受抗生素、消毒劑和環(huán)境脅迫影響，還可以促進(jìn)生物或非生物表面細(xì)胞的黏附、加速三維結(jié)構(gòu)和微菌落的形成以及誘導(dǎo)生物膜的成熟。第3階段為微菌落的形成階段。當(dāng)一定數(shù)量的固著微生物與同種或異種細(xì)胞相鄰并處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，會(huì)隨即形成具有三維結(jié)構(gòu)的單物種或混合物種微菌落[16]。微菌落是微生物生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，存在于其中的水分通道為營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入和代謝廢物的排出提供了一種有效途徑，并且可以通過自發(fā)消除受損個(gè)體的機(jī)制來維持群落的穩(wěn)定。在這個(gè)過程中，EPS有助于加強(qiáng)不同微菌落之間以及微菌落和基質(zhì)之間的黏附，并且在環(huán)境發(fā)生變化時(shí)起到穩(wěn)定菌落的作用。第4階段是生物膜的成熟階段。生物膜成熟后，內(nèi)部形成了能夠有效分配營養(yǎng)物質(zhì)及傳播膜內(nèi)信號(hào)的開放水通道。由于不同微生物所依賴的營養(yǎng)物質(zhì)不同，最終形成被EPS包圍的扁平狀、蘑菇狀或郁金香狀的不同組織結(jié)構(gòu)[17]。同時(shí)，微生物之間通過釋放一些特殊的信號(hào)分子來相互溝通和協(xié)調(diào)以進(jìn)行基因調(diào)控，這個(gè)過程被稱作群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[18]，在抑制微生物聚集效應(yīng)和生物膜的定植成熟等方面起到十分重要的作用。QS中的自誘導(dǎo)物主要包括4 種，首先是由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生N-?；呓z氨酸內(nèi)酯中的自誘導(dǎo)物-1（autoinducer-1，AI-1）和AI-3，其次是在革蘭氏陽性菌中存在的一種用于物種內(nèi)部交流的物質(zhì)，被稱為自誘導(dǎo)肽，最后一種是應(yīng)用于不同物種群落之間通信的AI-2 QS分子呋喃氧基-硼酸二酯[19]。

第5階段為擴(kuò)散階段。此階段細(xì)胞會(huì)從成熟的生物膜中分離，隨后擴(kuò)散到其他區(qū)域，并且恢復(fù)到浮游形態(tài)，重新進(jìn)入新的生物膜形成周期。能夠形成生物膜的微生物的細(xì)胞會(huì)由于各種原因而發(fā)生擴(kuò)散，如群體效應(yīng)的影響、營養(yǎng)狀態(tài)的改變、表面特性的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌的繁殖代謝和外部環(huán)境的影響等。主要的擴(kuò)散過程包括侵蝕、磨損和脫落[20]。首先，流體剪切力作用所導(dǎo)致的細(xì)胞侵蝕和分子顆粒之間碰撞所導(dǎo)致的表面磨損是一種小細(xì)胞群體或單個(gè)細(xì)胞的連續(xù)分離過程，只改變微生物生物膜表面的結(jié)構(gòu)，而脫落會(huì)導(dǎo)致大部分甚至全部的生物膜結(jié)構(gòu)損失，但是擴(kuò)散的發(fā)生往往是局部的[21-22]。

2 超聲技術(shù)的原理及抑制微生物生物膜污染的機(jī)制

早在20世紀(jì)20年代就已經(jīng)證實(shí)超聲可以作為一種環(huán)境友好的抑制微生物生物膜污染技術(shù)[23]。而近些年來，將超聲技術(shù)應(yīng)用于抑制微生物生物膜污染方面的研究越來越廣泛。目前已經(jīng)有多項(xiàng)研究表明超聲處理可以有效破壞生物膜結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑制污染的目的，在一定程度保持產(chǎn)品原有品質(zhì)的同時(shí)提高了其安全性[24-26]。

2.1 超聲技術(shù)的類型及技術(shù)特點(diǎn)

聲波主要分為3 個(gè)部分，包括次聲（頻率<20 Hz）、帶聲（20 Hz<頻率<20 kHz）和超聲（頻率>20 kHz），其中，超聲波由一系列高頻率聲波組成，起始頻率為20 kHz，接近人類聽覺范圍的上限[27]。超聲波按頻率不同可分為功率超聲（20～100 kHz）、高頻超聲（100 kHz～1 MHz）和診斷超聲（1～10 MHz）[28]。超聲波的2 個(gè)重要參數(shù)是功率密度（每毫升溶液所消耗的功率量，W/mL）和功率強(qiáng)度（每平方厘米發(fā)射器面積所消耗的功率量，W/cm2）[29]。在食品加工中，超聲波主要分為2 類：低強(qiáng)度高頻超聲波（功率強(qiáng)度<1 W/cm2、頻率100 kHz～1 MHz）和高強(qiáng)度低頻超聲波（功率強(qiáng)度>10 W/cm2、頻率20～100 kHz）[30]，

其中，低強(qiáng)度高頻超聲波通常用于表征食品成分、評(píng)估食品結(jié)構(gòu)和保證食品質(zhì)量，因?yàn)樗鼛缀醪粫?huì)導(dǎo)致被處理材料發(fā)生物理化學(xué)變化，而高強(qiáng)度低頻超聲波具有破壞性，可以使介質(zhì)內(nèi)部產(chǎn)生快速移動(dòng)的微氣泡流，經(jīng)過一系列變化最終氣泡劇烈破裂，進(jìn)而達(dá)到改性物料的目的，因此常用于食品加工領(lǐng)域[31]。

2.2 超聲技術(shù)抑制微生物生物膜污染的誘導(dǎo)機(jī)制

2.2.1 空化效應(yīng)

超聲技術(shù)抑制生物膜污染的主要作用機(jī)理與空化效應(yīng)有關(guān)。如圖1所示，最初，溶解的氣體和蒸汽通過擴(kuò)散產(chǎn)生氣泡;達(dá)到壓縮半周期時(shí)，氣泡開始收縮，但是由于壓縮過程中氣泡表面積的減少，使其排出的內(nèi)容物小于膨脹階段所吸收內(nèi)容物，從而導(dǎo)致氣泡向共振尺寸方向生長，這個(gè)過程被稱為矯正擴(kuò)散或整流擴(kuò)散;在臨界尺寸范圍內(nèi)，當(dāng)超聲波應(yīng)用頻率與氣泡壁振動(dòng)頻率相同時(shí)，相位耦合從而發(fā)生共振現(xiàn)象，導(dǎo)致氣泡在1 個(gè)壓縮周期內(nèi)發(fā)生破裂[32]?？栈?yīng)主要分為穩(wěn)定空化（非慣性空化）和瞬態(tài)空化（慣性空化）[33]。穩(wěn)定空化主要導(dǎo)致介質(zhì)微攪動(dòng)，液體中微小氣泡形成后經(jīng)過多次超聲波振蕩來增大其體積，一般不發(fā)生氣泡破裂;而瞬態(tài)空化中的氣泡壽命很短，它以極大的振幅不斷振動(dòng)，快速增長然后迅速崩潰，約在1 個(gè)超聲周期內(nèi)就發(fā)生劇烈的氣泡坍塌，破碎成體積更小的氣泡后再次進(jìn)入氣泡增長周期，循環(huán)往復(fù)[34]?？栈瘹馀莸奶騼?nèi)爆瞬間產(chǎn)生極高的壓力（可達(dá)到50 MPa），產(chǎn)生向外傳播的沖擊波，從而產(chǎn)生能夠破壞細(xì)胞的強(qiáng)機(jī)械力和剪切力，同時(shí)引起微觀湍流，也稱為空化區(qū)湍流現(xiàn)象，坍塌過程也會(huì)產(chǎn)生高溫（氣泡內(nèi)部達(dá)到5 500 ℃），使液體介質(zhì)發(fā)生熱分解從而產(chǎn)生自由基，此過程是超聲抑制生物膜污染的一個(gè)主要機(jī)制[35]。

空化效應(yīng)會(huì)破壞微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能、使細(xì)胞膜變薄、在一定程度上使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜分離、釋放細(xì)胞內(nèi)容物并且使酶失活，由介質(zhì)產(chǎn)生的高溫、高壓、自由基以及氣泡爆炸所產(chǎn)生的高剪切力、機(jī)械力和微觀湍流等效應(yīng)會(huì)使微生物生物膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，并產(chǎn)生大小不一的孔洞，此過程被稱為聲穿孔現(xiàn)象。這種穿孔效應(yīng)可以增加細(xì)胞膜的通透性，允許抗菌物質(zhì)通過孔洞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，破壞蛋白質(zhì)、酶和DNA，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)功能物質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制微生物生物膜污染的目的。

2.2.2 駐波效應(yīng)和微觀湍流

駐波效應(yīng)是指超聲設(shè)備向介質(zhì)發(fā)射超聲波的同時(shí)，聲波又從固體表面或氣-液界面反射回液體介質(zhì)中的過程，可導(dǎo)致強(qiáng)烈的空化作用。氣泡在膨脹、壓縮和坍塌周期中的表現(xiàn)為：在聲壓隨時(shí)間從最大值到最小值波動(dòng)的駐波壓力波腹處，所聚集的氣泡尺寸都小于共振尺寸;相反，在聲壓接近于零的壓力節(jié)點(diǎn)處，所聚集的氣泡尺寸都大于共振尺寸[36-37]。氣泡從壓力節(jié)點(diǎn)處向波腹處移動(dòng)的過程中，空化氣泡以比流體的平均速度快1 個(gè)數(shù)量級(jí)的速度在帶狀結(jié)構(gòu)中行進(jìn)，從而加速流體的傳遞速率，當(dāng)它們碰撞時(shí)氣泡之間會(huì)發(fā)生相互聚集，最終在接近微生物表面時(shí)發(fā)生坍塌，從而破壞微生物生物膜結(jié)構(gòu)，這種氣泡轉(zhuǎn)移的流動(dòng)過程被稱為微觀湍流[38]。

2.2.3 微射流

當(dāng)氣泡靠近微生物生物膜時(shí)，流體運(yùn)動(dòng)的幅度和方向迅速發(fā)生改變，在其表面引起一定程度的剪切力和阻力，從而發(fā)生由空化效應(yīng)誘導(dǎo)的氣泡坍塌，但這種坍塌通常是不對(duì)稱的，這個(gè)過程被稱為不對(duì)稱空化。而不對(duì)稱的空化效應(yīng)最終會(huì)導(dǎo)致速率超過100 m/s的微射流的形成[39]。微射流會(huì)轟擊微生物細(xì)胞，導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜變薄并在表面發(fā)生點(diǎn)蝕和侵蝕，從而達(dá)到抑制微生物生物膜污染效果，除此之外，微射流效應(yīng)還可以用來去除附著在表面上的顆粒達(dá)到清潔作用，或者用于加速聚集體分解成顆粒的過程[40]。

2.2.4 產(chǎn)生自由基

空化作用導(dǎo)致介質(zhì)發(fā)生熱分解，生成活性氧（reactive oxygen species，ROS）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2），它們被證明為有效的抗菌物質(zhì)[41]。相關(guān)反應(yīng)方程為（1）～（6）。

H2O→·OH+H· （1）

H·+H·→H2 （2）

·OH+·OH→H2O2 （3）

·OH+·OH→H2O+O2- （4）

H2O+·OH→H2O2+H· （5）

H2O+O·→2·OH （6）

空化過程中所產(chǎn)生的H2O2、ROS和·OH可以通過攻擊微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜來削弱其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，使內(nèi)部蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化。例如，·OH會(huì)攻擊某些氨基酸側(cè)鏈和雙鍵位置，使相應(yīng)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，并且使其特異性功能受到抑制;·OH還會(huì)與多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性、流動(dòng)性和通透性，加速自由基到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部的進(jìn)程;H2O2、·OH和ROS可以攻擊多糖和生物聚合物，影響細(xì)胞正常代謝;ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激和·OH都可通過DNA雙螺旋斷裂等方式破壞核酸結(jié)構(gòu)[42];同時(shí)還會(huì)使細(xì)胞內(nèi)壓力升高，與細(xì)胞內(nèi)聚合物發(fā)生反應(yīng)，干擾細(xì)胞正常的生長代謝活動(dòng)，導(dǎo)致一系列后果，包括蛋白質(zhì)變性、酶失活、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞甚至死亡。另外，在此過程中形成的NO2降低了溶液的pH值，這也會(huì)使微生物失活[43]。一般來說，生成的自由基數(shù)量與超聲頻率有關(guān)。低頻率超聲（20～100 kHz）產(chǎn)生的氣泡較大，崩潰更加劇烈，釋放的能量更多，但生成的氣泡數(shù)量較少，單位時(shí)間內(nèi)崩潰的次數(shù)也較少，這阻礙了·OH的生成和擴(kuò)散。而高頻率超聲（100 kHz～1 MHz）產(chǎn)生的氣泡較小，釋放的能量也較少，但氣泡數(shù)量較多，單位時(shí)間內(nèi)崩潰坍塌次數(shù)較多，這有利于·OH的生成和

擴(kuò)散[44-45]，因此，聲化學(xué)效應(yīng)在中、高頻超聲抑制污染過程中起到主導(dǎo)作用。

3 超聲技術(shù)抑制微生物生物膜污染的影響因素

最近的許多研究表明，盡管超聲波技術(shù)表現(xiàn)出良好的抑制微生物生物膜污染的能力，然而具體過程受多種因素的影響，包括超聲波的功率強(qiáng)度、振幅、溫度、外部施加壓力、流動(dòng)特性、表面張力、固體顆粒濃度、微生物的類型、形狀或體積等[46]。

3.1 超聲功率強(qiáng)度和振幅

低強(qiáng)度超聲（功率強(qiáng)度<1 W/cm2）可能會(huì)在一定程度上促進(jìn)微生物細(xì)胞及其產(chǎn)生的生物膜生長[47]，因?yàn)槠洚a(chǎn)生的穩(wěn)定空化對(duì)微生物生物膜所造成的損傷是可逆的，同時(shí)改變了微生物細(xì)胞的生存狀態(tài)，從而促進(jìn)其增殖代謝過程。而高強(qiáng)度超聲（功率強(qiáng)度>10 W/cm2）所產(chǎn)生的瞬間空化對(duì)微生物生物膜造成不可修復(fù)的損傷。一般來說，超聲功率強(qiáng)度增加會(huì)使空化氣泡數(shù)量增多和空化區(qū)域面積增大，從而使空化效應(yīng)更加劇烈，但是這個(gè)過程存在一個(gè)臨界點(diǎn)，超過該臨界功率水平時(shí)，功率強(qiáng)度仍持續(xù)增加，通常會(huì)導(dǎo)致空化效率降低[48]。造成這種現(xiàn)象的原因主要有3 個(gè)：首先，高功率強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致氣泡的體積膨脹到非常大，以至于氣泡沒有足夠的時(shí)間崩潰，從而使空化氣泡崩潰的頻率降低;其次，還會(huì)形成氣泡團(tuán)簇，它可以使功率強(qiáng)度逐層衰減，從而保護(hù)內(nèi)部氣泡防止其崩潰坍塌;最后，功率強(qiáng)度過高還會(huì)導(dǎo)致在發(fā)射器表面形成微氣泡聚集，從而使探頭表面積增大，而功率強(qiáng)度與探頭半徑或面積成反比，所以最終使超聲波功率強(qiáng)度衰減和空化效率降低。超聲的振動(dòng)幅度是指超聲波探頭尖端將聲波發(fā)送到介質(zhì)中時(shí)所經(jīng)過的最大位移，Merouani等[49]研究證明，氣泡的周圍半徑范圍隨超聲振幅的增大而增大，因而振幅的增大就意味著空化效應(yīng)的增強(qiáng)。

3.2 溫度和壓力

溫度改變會(huì)導(dǎo)致空化氣泡在液體中的擴(kuò)散速率、分散性、蒸汽壓和介質(zhì)黏度的變化，而這些因素都可以直接影響空化作用的強(qiáng)度，進(jìn)而影響超聲抑制微生物生物膜污染的效果和速率。溫度的升高通常伴隨著氣體擴(kuò)散速率、分散性和蒸汽壓的增大，這將降低空化閾值[50]，提高空化氣泡形成速率，但是會(huì)減弱氣泡坍塌的劇烈程度。當(dāng)溫度進(jìn)一步提高至沸點(diǎn)時(shí)，會(huì)形成數(shù)量巨大的氣泡群，進(jìn)而導(dǎo)致超聲能量顯著遞減。此外，由于黏性液體無法產(chǎn)生空化效應(yīng)，所以必須將液體黏度最小化，而大多數(shù)液體的黏度都會(huì)隨著溫度的升高而降低[51]。在超聲應(yīng)用過程中，由于介質(zhì)粒子的振動(dòng)、氣泡活動(dòng)及空化效應(yīng)所引起的瞬間區(qū)域高溫會(huì)導(dǎo)致樣品溫度持續(xù)上升，所以在實(shí)際應(yīng)用中，為了使空化效率最大化，合適的溫度是十分必要的。壓力增加會(huì)使空化閾值增大，導(dǎo)致在相同強(qiáng)度超聲下所產(chǎn)生的空化氣泡減少，但會(huì)導(dǎo)致更加迅速和劇烈的空化氣泡坍塌。

3.3 流動(dòng)特性、表面張力和固體顆粒濃度

當(dāng)超聲波作用于靜態(tài)液體介質(zhì)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定的聲波反射，因此駐波效應(yīng)在靜態(tài)流體中的效果比較明顯，而在流動(dòng)液體介質(zhì)中時(shí)，空化效應(yīng)所施加的機(jī)械力可以使從膜上脫離的顆粒自由流動(dòng)而遠(yuǎn)離生物膜污染區(qū)域，所以空化效應(yīng)在流動(dòng)狀態(tài)條件下效果更加顯著[52]。通常液體中的表面張力增加會(huì)在一定程度上導(dǎo)致空化效應(yīng)的加強(qiáng)，但是在高表面張力液體介質(zhì)中，空化氣泡的形成會(huì)受到抑制[53]。固體顆粒濃度升高會(huì)導(dǎo)致液體介質(zhì)濃度增大，從而增加了聲波在介質(zhì)中傳遞的阻力，使其強(qiáng)度衰減，衰減程度與介質(zhì)類型、實(shí)驗(yàn)要求和外部條件等因素有關(guān)[54]。

3.4 微生物的類型、形狀或體積

除了超聲本身的參數(shù)及介質(zhì)的特性外，微生物生物膜的類型、形狀或體積等同樣也可以影響超聲抑制微生物生物膜污染的效果。例如，在超聲處理過程中，相對(duì)于革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌更加穩(wěn)定，這是由于革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁更厚，導(dǎo)致其形成的生物膜結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，并且內(nèi)部肽聚糖（厚度20～80 nm）的黏附層結(jié)合更加緊密，使聲波傳遞過程中的強(qiáng)度大幅衰減，從而起到保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)的作用[55]。當(dāng)細(xì)菌以球狀存在，通常會(huì)導(dǎo)致超聲發(fā)生有規(guī)律的逐層衰減，所以球狀細(xì)菌比其他形狀的細(xì)菌具有更高的穩(wěn)定性;與聚集體積較小的生物膜相比，體積較大的生物膜結(jié)構(gòu)擁有更大的表面積，導(dǎo)致其對(duì)超聲作用更加敏感[56]。

4 超聲技術(shù)在肉及肉制品中的應(yīng)用及問題

4.1 超聲技術(shù)在肉及肉制品中的應(yīng)用

肉及肉制品中富含水分、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等營養(yǎng)成分，有利于食源性微生物的生長繁殖，極易在生產(chǎn)、流通、銷售和貯藏等過程中發(fā)生腐敗變質(zhì)，并導(dǎo)致食品安全問題。目前，國內(nèi)外許多研究表明，超聲可有效抑制肉及肉制品的微生物污染。表1列舉了一些有關(guān)于超聲抑菌技術(shù)在肉及肉制品中應(yīng)用的典型文獻(xiàn)，并列出了處理過程中的具體參數(shù)（超聲頻率、強(qiáng)度、時(shí)間）以及具體的抑菌效果。

許多研究已經(jīng)指出，超聲技術(shù)對(duì)生鮮肉的抑菌作用明顯。Caraveo等[57]將超聲處理牛半腱肌于4 ℃下貯藏14 d以觀察微生物的生長情況，結(jié)果證明，超聲可有效抑制牛半腱肌貯藏過程中大腸菌群和嗜冷菌等微生物的生物膜污染，在最大程度保持牛肉品質(zhì)特性的同時(shí)，顯著抑制了菌群數(shù)量的增加，并沒有出現(xiàn)明顯的腐敗現(xiàn)象。同樣，Carrillo-Lopez等[58]證明超聲可有效抑制牛背長肌中嗜溫、嗜冷和大腸菌群污染。Pi?on等[59]對(duì)雞胸肉進(jìn)行不同時(shí)間的超聲處理，并指出由于金黃色葡萄球菌（屬革蘭氏陽性球菌）對(duì)超聲處理較不敏感，30 min處理不足以減少其數(shù)量，而當(dāng)進(jìn)行50 min的超聲處理時(shí)，顯著降低了金黃色葡萄球菌和沙門氏菌含量，證明在應(yīng)用過程中超聲時(shí)間以及微生物種類和形態(tài)等對(duì)殺菌效果有顯著影響。Bonah等[60]證明超聲可有效抑制豬肉表面病原菌污染，同時(shí)抑制貯藏過程病原菌生長速率。對(duì)于魚類生鮮制品同樣也有類似的研究報(bào)道[61]。這說明超聲技術(shù)對(duì)不同來源生鮮肉的抑菌作用具有廣泛的適用性。

除了生鮮肉類外，超聲技術(shù)在抑制熟肉制品生產(chǎn)加工過程中/后期的微生物污染中的應(yīng)用也得到了廣泛的研究。Zhang Jian等[62]通過研究超聲波輔助烹飪五香牛肉的冷藏品質(zhì)得出，超聲波可抑制微生物污染并減緩風(fēng)味的惡化，減少貯藏過程中的脂肪氧化和蛋白質(zhì)降解。超聲技術(shù)還可以在牛肉的腌制過程中使鹽水中的大腸桿菌O157：H7和蠟樣芽孢桿菌失活[63]，研究發(fā)現(xiàn)，空化產(chǎn)生的大量H2O2證實(shí)超聲自由基反應(yīng)可輔助微生物滅活，此外，超聲處理可通過破壞微生物膜完整性達(dá)到抑制生物膜污染及抑菌效果。超聲處理熱狗香腸可延長保質(zhì)期[64]。Aguilar等[65]證明，脈沖超聲可顯著抑制生肉乳劑（蛋白質(zhì)、脂肪質(zhì)量比0.5∶1.0）中天然微生物菌群的生物膜污染，由于微生物種類的不同其作用效果也存在差異，但是需要嚴(yán)格控制處理時(shí)間以避免在實(shí)際應(yīng)用中造成肉及其制品質(zhì)地和感官方面的劣變。

超聲技術(shù)還可以作為一種輔助手段和其他殺菌方法（熱處理、非熱處理及化學(xué)殺菌劑）聯(lián)用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高殺菌強(qiáng)度和效率。例如，Li Jiao等[66]的研究表明，單獨(dú)超聲處理10 min會(huì)使金黃色葡萄球菌數(shù)量減少0.36（lg（CFU/mL）），弱酸性電解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）處理10 min減少3.06（lg（CFU/mL）），而聯(lián)合處理可減少3.68（lg（CFU/mL）），證明超聲和SAEW對(duì)抑制金黃色葡萄球菌生物膜污染具有協(xié)同性。Guo Mingming等[67]

證明百里香納米乳液（0.375 mg/mL）聯(lián)合超聲技術(shù)（20 kHz、255 W/cm2、9 min）使大腸桿菌O157：H7數(shù)量減少（7.42±0.27）（lg（CFU/mL）），聯(lián)合處理可顯著增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，改變細(xì)胞的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致更多內(nèi)容物泄露，從而達(dá)到協(xié)同抑制生物膜的效果。Guo Liping等[68]研究表明，應(yīng)用超聲波（25 kHz、10 W/cm3）和30 mg/L次氯酸鈉進(jìn)行聯(lián)合處理，在抑制大腸桿菌生物膜污染方面顯示出協(xié)同增效作用。

Evelyn等[69]先將牛肉泥進(jìn)行熱處理（95、100、105 ℃）后再進(jìn)行超聲（162 W），會(huì)加速產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的失活。單獨(dú)超聲處理在抑制酶活性的同時(shí)導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，從而產(chǎn)生致死效應(yīng);而單獨(dú)熱處理一般會(huì)使能夠產(chǎn)生生物膜的微生物處于亞致死損傷狀態(tài)，不僅不能達(dá)到抑制生物膜污染的目的，還對(duì)食品品質(zhì)有所影響[70]。而熱-超聲聯(lián)合處理存在協(xié)同效應(yīng)，首先，超聲降低了微生物的耐熱性，其次，在高于50 ℃的條件下微生物生物膜對(duì)超聲更加敏感，通過減少亞致死細(xì)胞的數(shù)量，達(dá)到抑制微生物生物膜污染的目的[71]。超聲技術(shù)與其他方法聯(lián)用在肉及肉制品中的一些應(yīng)用如表2所示。

超聲技術(shù)除了直接應(yīng)用于肉及肉制品本身外，在肉制品加工工廠中，對(duì)于去除加工設(shè)備或工具表面的生物膜以及廢水處理也有著重要意義。Du Cezhi等[79]發(fā)現(xiàn)，超聲浴（100 kHz、0.22 J/mm2）清洗拋光后的不銹鋼316 L樣品（長度10 mm、寬度10 mm、厚度2 mm）后，附著其上的金黃色葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定程度的破壞，從而顯著降低了其表面附著力。Brasil等[80]證明超聲波可對(duì)屠宰牛的刀具進(jìn)行有效清潔和消毒。此外，超聲處理廢水可以有效抑制潛在的生物膜形成[81]，從而改善系統(tǒng)的使用壽命。除了用于抑制生物膜污染外，超聲技術(shù)還廣泛應(yīng)用于肉及肉制品的嫩化[82]、乳化[83]、凝膠化[84]，以及肉的冷凍[85]、解凍[86]和腌制[87]等加工過程中，改善肉及肉制品的品質(zhì)。

4.2 超聲技術(shù)在肉及肉制品應(yīng)用中的問題

盡管超聲技術(shù)在肉及肉制品中已經(jīng)有大量的應(yīng)用和潛在的用途，但目前仍然存在一些問題。首先，目前對(duì)于超聲設(shè)備的研究、選擇、作用方式以及針對(duì)不同微生物生物膜和不同食品超聲波的頻率、功率強(qiáng)度、振幅和作用時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)的設(shè)定還未形成一個(gè)成熟體系，這些因素決定了微生物滅活的效率，后續(xù)需要做更多的工作和更深入的研究，使其效率升高同時(shí)拓寬其應(yīng)用范圍。其次，在某些條件下超聲過程中產(chǎn)生的ROS和H2O2等活性物質(zhì)會(huì)與不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，使脂肪部分氧化，所以在超聲處理脂肪含量較高的肉類及其制品時(shí)有可能產(chǎn)生不良風(fēng)味。例如，Kang Dacheng等[88]利用超聲處理牛肉時(shí)，顯著增強(qiáng)了牛肉中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化，從而引起異味而導(dǎo)致質(zhì)量下降。Gómez-Salazar等[89]利用超聲（40 kHz、110 W）處理腌制兔肉誘發(fā)自由基等活性物質(zhì)產(chǎn)生，加速了脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的氧化。Alves等[90]利用超聲（25 kHz、500 W、9 min）處理意大利臘腸后發(fā)現(xiàn)，超聲加速脂質(zhì)（過氧化值和硫代巴比妥酸反應(yīng)物值）和蛋白質(zhì)（巰基）的氧化，對(duì)意大利臘腸的品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。綜上所述，雖然超聲技術(shù)在應(yīng)用于抑制微生物生物膜污染方面已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，且已經(jīng)證明其有效性及商業(yè)應(yīng)用的可能性，但要將此技術(shù)廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中時(shí)，仍存在許多需要解決的問題。

5 結(jié) 語

隨著人民生活水平的不斷提高和經(jīng)濟(jì)的改善以及科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)肉及肉制品的安全性提出了更高的要求。但目前，廣泛使用的熱殺菌和化學(xué)殺菌方法存在許多問題，主要表現(xiàn)在其會(huì)導(dǎo)致一定程度的營養(yǎng)流失、對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和感官特性等會(huì)產(chǎn)生不良影響、易產(chǎn)生交叉抗性和健康風(fēng)險(xiǎn)等。許多研究指出，與傳統(tǒng)的殺菌手段相比，超聲技術(shù)具有操作簡便、節(jié)約能源和安全清潔等優(yōu)勢(shì)，可以有效抑制微生物生物膜污染，同時(shí)在一定程度上改善傳統(tǒng)殺菌方式對(duì)食品感官品質(zhì)的不良影響，在食品行業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。近年來，國內(nèi)外有諸多研究報(bào)道了超聲技術(shù)可以有效抑制肉及肉制品加工過程中的微生物膜污染。然而，就目前的研究現(xiàn)狀而言，超聲技術(shù)在肉制品殺菌中的應(yīng)用仍面臨著一些挑戰(zhàn)。例如：目前仍未形成系統(tǒng)的超聲抑菌體系，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用;此外，由超聲引發(fā)的促氧化因子（如ROS和H2O2）會(huì)催化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這在肉及肉制品中會(huì)誘導(dǎo)一定程度的脂質(zhì)氧化，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生一些不良風(fēng)味，不利于產(chǎn)品品質(zhì)。因此，在今后的研究中，需要對(duì)超聲技術(shù)的工藝條件及各種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，拓寬其應(yīng)用范圍，更加深入研究超聲技術(shù)與其他殺菌工藝聯(lián)用的作用效果，另外還應(yīng)針對(duì)不同的工業(yè)需求設(shè)計(jì)和開發(fā)專用型超聲波殺菌設(shè)備，以實(shí)現(xiàn)快速、高效、環(huán)境友好的工業(yè)化肉及肉制品等食品殺菌。

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