一株貝萊斯芽孢桿菌的分離與鑒定

繆伏榮，陳鑫珠，邱華玲，劉 景

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013）

0 引言

茶渣是茶飲料、速溶茶和茶單寧產(chǎn)業(yè)等加工茶葉后產(chǎn)生的殘?jiān)?，?jù)統(tǒng)計(jì)，僅茶飲料和速溶茶公司每年產(chǎn)生的茶渣超10萬t。研究報(bào)道，干基的茶渣粗蛋白質(zhì)含量為17%～25%，是一種良好的蛋白質(zhì)飼料資源[1-3]。日本研究者[4]、高風(fēng)仙[5]和陳曉虹[6]以茶渣為添加劑喂養(yǎng)禽畜不僅可以降低成本，還可以一定程度上改善畜牧產(chǎn)品的質(zhì)量，提高經(jīng)濟(jì)效益。但馬幫軍[7]研究表明，豬日糧中添加茶粉1%～3%會(huì)降低豬的平均日增重；舒慶齡[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在肉雞飼料中添加茶渣3%～5%，喂養(yǎng)60天，肉雞增重明顯低于對(duì)照組。這主要原因是茶渣粗纖維含量高，畜禽纖維素酶活力低，不利于吸收利用；其次剛出產(chǎn)的茶渣水分達(dá)到80%不易儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，因此僅有小部分的茶渣作為飼料源利用，大部分茶渣被丟棄或掩埋；這不僅造成資源浪費(fèi)，而且造成生態(tài)環(huán)境污染[9-10]。為了更好利用茶渣資源，劉姝等[11]利用木霉等組合微生物發(fā)酵茶渣，30℃，經(jīng)4～8天發(fā)酵后測(cè)定飼料中粗蛋白含量達(dá)到25%以上，比對(duì)照組提高了20%，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值達(dá)到了仔豬配合飼料中粗蛋白的含量。胡桂萍等[12]以提取茶多酚后的茶渣為發(fā)酵原料，利用乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和米曲霉菌進(jìn)行常溫(25～35℃)的厭氧固態(tài)發(fā)酵5～7天，發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量達(dá)29.49%。倪星虹[13]以混合菌種溫度28℃、發(fā)酵7天，茶渣發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量提高了60.78%。朱飛等[14]利用黑曲霉在添加5%玉米粉的茶渣中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，自然pH、37℃、8天發(fā)酵后顯著提高茶渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，茶渣經(jīng)發(fā)酵后雖然能在一定程度上提高茶渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但發(fā)酵溫度均不超過37℃，發(fā)酵效率低，時(shí)間長(zhǎng)，易被雜菌污染。因此有必要篩選能高效分解茶渣的高溫菌株。貝萊斯芽抱桿菌(Bacillusvelezensis)是2005年由Ruiz-Garcia等[15]新命名的一種生防菌，是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種[16-19]。國(guó)內(nèi)外己有學(xué)者研究表明Bacillusvelezensis能產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，包括纖維素酶、蛋白酶以及多種抗菌的活性物質(zhì)，是用來增加作物產(chǎn)量、維護(hù)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的首選生物藥劑[20-28]。貝萊斯芽孢桿也作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌[29]。Liu等[30]對(duì)從海洋微生物中篩選到菌株BacillusvelezensisH3的發(fā)酵培養(yǎng)基和拮抗物質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌株的活性物質(zhì)是一種替代性的表面活性素，有較高的研究?jī)r(jià)值。但鮮見貝萊斯芽抱桿菌(Bacillusvelezensis)分離茶渣的研究報(bào)道。

本研究從堆積廢棄茶渣中分離到即耐高溫又能產(chǎn)生較高酶活力的貝萊斯芽孢桿菌，對(duì)該菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)研究其最適的生長(zhǎng)條件，為后續(xù)的茶渣開發(fā)研究奠定理論的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

LB培養(yǎng)液(L)：酵母粉10 g，蛋白胨10 g，牛肉浸膏5 g，NaCl 10 g，pH 5.5～6.0。

純化固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)液中時(shí)加入20 g瓊脂粉。

分離固體培養(yǎng)基：取新鮮茶渣50 g加蒸餾水500 mL蒸煮30 min，過濾后的茶渣液定容到200 mL，加入4 g瓊脂粉。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：同LB培養(yǎng)液。

主要儀器：LRH-250A生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-1FD單人超凈工作臺(tái)、LDZS-30KBS立式高壓滅菌器、CRY-200恒溫?fù)u床、Multiskan MK3酶標(biāo)儀等。

試劑：酵母粉、蛋白胨、NaCl、硫酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、辛醇、鹽酸等均為AR級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與分離

（1）富集培養(yǎng)：從某地堆積多年的茶渣處取樣品10 g，加入盛有30 mL LB培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，在42℃、120 r/min條件下富集培養(yǎng)24 h，取2 mL培養(yǎng)物接種到新鮮的LB培養(yǎng)液，以相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)。如此重復(fù)3次。

（2）初篩：富集培養(yǎng)物在分離固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，42℃培養(yǎng)24 h。挑取生長(zhǎng)明顯的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

（3）復(fù)篩：將初篩菌落在純化固體培養(yǎng)基上劃線分離3次，以獲得純培養(yǎng)物，并依據(jù)菌種在分離固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況，挑取有不同形態(tài)特征的單菌落，于42℃ LB培養(yǎng)基上分別擴(kuò)繁后加20%甘油混勻，于-80℃條件下保存。

1.2.2 菌株產(chǎn)酶能力測(cè)定 選取生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。將菌株活化24 h后挑取1環(huán)至用液體發(fā)酵培養(yǎng)液中，42℃、120 r/min條件下培養(yǎng)48 h后，測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶、纖維素酶的活力。

采用蒽酮比色法測(cè)定纖維素酶(CL)催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量[31]。每mL樣本每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

酸性蛋白酶(ACP)、中性蛋白酶(NP)和堿性蛋白酶(AKP)的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB/T23527-2009和相關(guān)文獻(xiàn)[32-33]執(zhí)行。

1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察 篩選獲得的菌株，平板劃線42℃分別培養(yǎng)16 h和25 h，在自然光下觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色后，觀察菌株形態(tài)[34-35]。

1.2.4 菌株生理生化特性 糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、油脂試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)參考參照文獻(xiàn)[36-37]進(jìn)行。

1.2.5 分子鑒定 菌株的分子鑒定用16S rDNA和gyrB基因進(jìn)行[38]。以下細(xì)菌擴(kuò)增引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對(duì)所測(cè)的16S rDNA和gyrA序列進(jìn)行同源性分析，確定親緣關(guān)系，使用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joining[39-41]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算。

1.2.6 菌株生長(zhǎng)特性 首先測(cè)量菌株的生長(zhǎng)曲線，判斷最適生長(zhǎng)溫度以及生長(zhǎng)代時(shí)[42]。其次對(duì)其他生長(zhǎng)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)按表1中的設(shè)計(jì)方案，分析不同因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，其他培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基相同，間隔2 h取樣用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)630 nm處測(cè)吸光度。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 菌株生長(zhǎng)條件單因素試驗(yàn)

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0生統(tǒng)軟件進(jìn)行分析，f檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)酶能力比較

對(duì)5株菌的發(fā)酵液進(jìn)行分析，產(chǎn)纖維素酶(CL)活力由高到低分別是DJ、8106、Fb、8116、HLH；酸性蛋白酶(ACP)活力由高到低分別是8106、8116、DJ、HLH、Fb；中性蛋白酶(NP)活力由高到低分別是8106、HLH、8116、DJ、Fb；堿性蛋白酶(AKP)活力由高到低分別是Fb、8116、8106、DJ、HLH（表2）。可見Fb株菌產(chǎn)4種酶的活力均較強(qiáng)。

表2 菌株酶活力比較

2.2 菌落形態(tài)和菌株形態(tài)

Fb菌株在自然光下，LB培養(yǎng)基，42℃培養(yǎng)16 h，其菌落淺黃色，圓形，表面干燥，不透明，邊緣不整齊，如圖1。菌體呈桿狀，0.4～0.6 μm×0.9～4.0 μm，單個(gè)或成對(duì)排列，見圖2。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 菌株形態(tài)

2.3 菌株生理生化特性

由表3可知，F(xiàn)b菌株能水解七葉苷；吲哚試驗(yàn)陽性；可在β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶等酶中生長(zhǎng)；能利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-核糖等多種糖作為碳源生長(zhǎng)；但不能利用肌醇、L-鼠李糖、菊粉、環(huán)糊精、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-塔格糖、糖原、麥芽三糖、D-松三糖等。Fb菌株能在低劑量的抗菌素中生長(zhǎng)，其卡那霉素、竹桃霉素和多粘菌素B耐藥劑量分別是0.2 g/L、0.1 g/L和0.031 g/L。

表3 Fb菌株生理生化特性

2.4 菌株的分子鑒定

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast程序分析結(jié)果表明，F(xiàn)b菌株與BacillussiamensisKCTC13613(AJVF01000043)和BacillusamyloliquefaciensDSM 7T(FN597644)菌株的同源性最高，相似性達(dá)到99.93%。采用MEGA 5.0軟件，鄰位鏈接法顯示Fb菌株與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。菌株gyrB測(cè)序分析表明，序列長(zhǎng)1176 bp。MEGA5.0軟件分析結(jié)果表明，其與BacillusvelezensisBCRC 17467T(DQ903176)的同源性較高，相似性達(dá)到100%。同理將該菌株與其他種屬明確的10株菌的gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。

圖3 基于16S rDNA的相似菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于gyrB的相似菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA和gyrB的序列比較分析，將Fb菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

2.5 菌株生長(zhǎng)特征

2.5.1 Fb菌株的生長(zhǎng)曲線 從圖5可以看出，F(xiàn)b菌株可在30～60℃下生長(zhǎng)，在30～39℃培養(yǎng)時(shí)隨著培養(yǎng)溫度的提高菌株的細(xì)胞分裂加快，即吸光值增加；在39～54℃培養(yǎng)時(shí)其吸光值(0.89～0.93)最高，組間差異不顯著；54～60℃隨著培養(yǎng)溫度的提高吸光值下降；因此Fb菌株最適的生長(zhǎng)溫度為39～54℃。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.5.2 裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，隨著裝液量的增加，菌液的吸光值升高，至裝液量30 mL時(shí)，F(xiàn)b菌株的吸光值達(dá)最高0.97；再提高裝液量，吸光值逐漸降低（圖6）。從圖7可知，裝液量30 mL時(shí)，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，吸光值升高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)，F(xiàn)b菌株的吸光值達(dá)到最高0.98；再提高搖床轉(zhuǎn)速，吸光值逐漸降低。表明Fb菌株最佳裝液量和搖床轉(zhuǎn)速分別為30 mL和120 r/min。

圖6 裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.5.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Fb菌生長(zhǎng)的影響 圖8為Fb菌株在培養(yǎng)溫度42℃下的生長(zhǎng)曲線。0～6 h是菌體適應(yīng)新環(huán)境的遲緩期，細(xì)胞分裂增殖緩慢；6～16 h為生長(zhǎng)繁殖迅速的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；16 h的菌體吸光值最高0.974；16～18 h為穩(wěn)定生長(zhǎng)期；18 h后由于自溶酶作用或有毒代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞裂解菌體吸光值隨之下降。表明Fb菌的最適培養(yǎng)時(shí)間為16 h。

圖8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Fb菌生長(zhǎng)的影響

2.5.4 初始pH對(duì)Fb菌生長(zhǎng)的影響 從圖9可以看出，培養(yǎng)基初始pH 4.0～5.0時(shí)，菌體吸光值隨pH的提高而提高；培養(yǎng)基初始pH 5.0～7.0范圍內(nèi)，F(xiàn)b菌生物量較高且各組間差異不顯著，吸光值均高0.93；再逐漸提高培養(yǎng)基的初始pH培養(yǎng)時(shí)，菌體吸光值隨之下降；表明Fb菌株的培養(yǎng)基最適初始pH 5.0～7.0。

圖9 初始pH對(duì)Fb菌生長(zhǎng)的影響

2.5.5 鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 實(shí)驗(yàn)中改變培養(yǎng)基的鹽度，來研究Fb菌株生長(zhǎng)最適的鹽度。從圖10可以看出，培養(yǎng)液的鹽度從0.0增加到1.0%菌株的吸光值也從0.46增加到0.92；培養(yǎng)液的鹽度1.0%～6.0%菌株的吸光值均大于0.92，無顯著差異；6.0%～7.0%菌株的吸光值下降至0.81。

圖10 鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

研究表明，在固態(tài)發(fā)酵中，適宜的水分和原料粒度能夠保證發(fā)酵基質(zhì)深層微生物對(duì)氧氣的需求，疏松多孔的基質(zhì)狀態(tài)還能使得微生物的代謝廢物及時(shí)排出，基質(zhì)內(nèi)部的養(yǎng)分也可隨著自由水通過原料間隙擴(kuò)散到基質(zhì)表面，滿足基質(zhì)表面微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，有利于微生物正常繁殖并保持高產(chǎn)酶活性狀態(tài)[43-44]。對(duì)于含水率高的物料一般選擇吸水性強(qiáng)的鋪料如麥麩等來降低物料的含水率；或選擇中高溫菌發(fā)酵利于物料中水分蒸發(fā)。本研究獲得貝萊斯芽孢桿菌Fb屬高溫菌，茶渣經(jīng)7天發(fā)酵后水分下降了42.06%(P＜0.05)，可有效解決新鮮茶渣水分過高的問題。此外Fb菌株的生長(zhǎng)溫度均高于劉姝等[11]、胡桂萍等[12]、倪星虹[13]和朱飛等[14]的發(fā)酵菌株，這不僅可減少其他雜菌生長(zhǎng)，而且可提高發(fā)酵效率。

本研究從堆積多年的茶渣中分離篩選到5株茶渣降解菌，其中一株Fb菌株經(jīng)菌落形態(tài)、菌株形態(tài)、生理生化特性的研究，及分子鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。該菌最適生長(zhǎng)條件為：裝液量30 mL、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、培養(yǎng)溫度39～54℃、培養(yǎng)時(shí)間為16 h、初始pH5.0～7.5、鹽度為1.0%～6.0%。同時(shí)，F(xiàn)b菌株產(chǎn)生具有較強(qiáng)酶活力的纖維素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。與胡寶東等[45]從醬香型大曲中分離獲得的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（即貝萊斯芽胞桿菌)FBKL 1.0190相似。Fb菌株是否在發(fā)酵過程中還會(huì)產(chǎn)生一些抗菌的活性物質(zhì)[20-28]和表面活性素[30]，這有待下一步的研究。本研究在茶渣中分離篩選出貝萊斯芽抱桿菌鮮見報(bào)道。