氣相色譜法分析甾烯醇

肖蘇熠，孫長(zhǎng)恩，闞曉麗

（國(guó)家農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇南京 210029）

甾烯醇（C29H50O）一般從棉籽內(nèi)提取，還可以從食用油脂精煉過(guò)程產(chǎn)生的植物油脫臭餾出物中提純。甾烯醇可以抑制病毒復(fù)制，通過(guò)降低植物核酸酶的活性，抑制合成病毒，是天然的抑菌藥物。甾烯醇通過(guò)改變寄主細(xì)胞的代謝使病毒無(wú)法增殖，從而對(duì)水稻矮縮病、小麥病毒病、煙草病毒病、蔬菜病毒病等均有防治效果。采用氣相內(nèi)標(biāo)法定量分析其含量，具有操作簡(jiǎn)便、精確度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑

甾烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，陜西上格之路生物科學(xué)有限公司；正丁醇、膽固醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與條件

Agilent 7890A 型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司。30 m×0.32 mm（i.d.）DB-1 毛細(xì)管柱，膜厚0.25 μm（或具同等效果的色譜柱）；柱室： 180 ℃保持1 min，以10 ℃/ min 升溫速率升到270 ℃，保持15 min，氣化室：290 ℃，檢測(cè)器室： 300 ℃； 載氣為N2：2.0 mL/min；燃燒氣為H2，35 mL/min；助燃?xì)鉃榭諝猓?00 mL/min；分流比：10 ∶ 1；微量進(jìn)樣器：10 μL。

以上操作參數(shù)為典型參數(shù)，可根據(jù)不同儀器特點(diǎn)，對(duì)操作參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以期獲得最佳效果。

1.3 樣品制備

1.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

稱取膽固醇0.40 g（精確至0.01 g）于100 mL 容量瓶中，用正丁醇溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.2 標(biāo)樣溶液的配制稱取0.03 g（精確至0.000 1 g）甾烯醇標(biāo)樣于25 mL 容量瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液，用正丁醇稀釋至刻度，搖勻。

1.3.3 試樣溶液的配制

1.3.3.1 甾烯醇母藥試樣溶液的配制

稱取甾烯醇母藥樣品3 g 于25 mL 容量瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液，用正丁醇稀釋至刻度，搖勻。

1.3.3.2 甾烯醇微乳劑試樣溶液的配制

稱取甾烯醇微乳劑樣品20 g 于50 mL 容量瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液，搖勻。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 線性關(guān)系

分別稱量甾烯醇標(biāo)樣0.2011 g、15.41 mg、29.92 mg、40.93 mg、60.61 mg 于1～5 號(hào)容量瓶中（1 號(hào)為200 mL，2～5 號(hào)為25 mL），1 號(hào)加正丁醇定容至刻度、搖勻，得甾烯醇母液，2～5 號(hào)分別加5 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，加入正丁醇定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確移1 號(hào)容量瓶溶液中甾烯醇母液5 mL 于6 號(hào)25 mL 容量瓶中，加5 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，加入正丁醇定容至刻度，搖勻。

配制甾烯醇5 個(gè)不同濃度的線性相關(guān)溶液，分別標(biāo)記為STD1～STD5。在“1.2”操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照STD1 至STD5 的順序測(cè)定每個(gè)溶液中甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比，取兩次測(cè)定的平均結(jié)果。

1.4.2 精密度

稱取甾烯醇母藥樣品3.0 g 于25 mL 容量瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液,用正丁醇稀釋至刻度，搖勻。得精密度溶液，分別標(biāo)記為甾烯醇母藥-A1～甾烯醇母藥-A5。

稱取甾烯醇微乳劑樣品20 g 于50 mL 容量瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液，搖勻，得精密度溶液，分別標(biāo)記為甾烯醇微乳劑-A1～甾烯醇微乳劑-A5。

以甾烯醇線性相關(guān)溶液STD3 為標(biāo)樣溶液，在“1.2”操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 準(zhǔn)確度

稱取甾烯醇標(biāo)樣0.233 0 g 于200 mL 容量瓶中作為甾烯醇母液，稱取甾烯醇母藥樣品1.5 g 于25 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液和10 mL 甾烯醇母液及5 mL 正丁醇，搖勻。分別取上述母液于5個(gè)進(jìn)樣瓶中，標(biāo)記為TK-B1～TK-B5。

稱取甾烯醇標(biāo)樣0.151 1 g 于200 mL 容量瓶中作為甾烯醇母液，稱取甾烯醇微乳劑樣品10 g 于25 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液和10 mL 甾烯醇母液，搖勻，標(biāo)記為ME-B1～ME-B5。

以甾烯醇線性相關(guān)溶液STD3 為標(biāo)樣溶液，在“1.2”操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.5 計(jì)算

將測(cè)得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比分別進(jìn)行平均。試樣中甾烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式（1）計(jì)算。

式（1）中，ω1為試樣中甾烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；r2為試樣溶液中甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；m1為標(biāo)樣的質(zhì)量，g；ω為標(biāo)樣中甾烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；r1為標(biāo)樣溶液中甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；m2為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

以甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。從圖1 可以看出，當(dāng)甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比在0.178 8～2.153 9 之間（甾烯醇質(zhì)量濃度201.2～242 4.4 mg/L），與相應(yīng)的甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計(jì)算得回歸方程為y=0.993 1x-0.009 8，相關(guān)系數(shù)r=1，可以滿足定量分析要求。本方法中甾烯醇標(biāo)樣質(zhì)量濃度為1 196.8 mg/L（進(jìn)樣體積1 μL）。

2.2 甾烯醇的氣相方法精密度試驗(yàn)

圖1 甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比與質(zhì)量比線性關(guān)系圖

精密度結(jié)果見表1～4。從表2 和表3 可以看出，甾烯醇母藥中甾烯醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的RSD為2.47%，小于修改的Horwitz 公式2(1-0.51gC)×0.67=3.11（其中C為樣品中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值，以小數(shù)計(jì)；如20.12%，C=0.201 2），表明甾烯醇分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。從表3 和表4 可以看出，甾烯醇微乳劑中甾烯醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的RSD為1.22%，小于修改的Horwitz 公式2(1-0.51gC)×0.67=4.11，表明甾烯醇分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

2.3 甾烯醇的氣相方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

準(zhǔn)確度結(jié)果見表4～5。從表4 可以看出，甾烯醇母藥中甾烯醇平均回收率為100.52%，具有良好的準(zhǔn)確度；從表5 可以看出，甾烯醇微乳劑中甾烯醇平均回收率為102.60%，具有良好的準(zhǔn)確度。

2.4 原始圖譜

試驗(yàn)中氣相色譜圖如圖2～12 所示。

表1 甾烯醇母藥精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 甾烯醇母藥中甾烯醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 單位：%

表3 甾烯醇微乳劑中甾烯醇精密度試驗(yàn)結(jié)果

表4 甾烯醇微乳劑中甾烯醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 單位：%

表4 甾烯醇母藥回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 甾烯醇微乳劑回收率試驗(yàn)結(jié)果

圖2 空白氣相色譜圖（甾烯醇標(biāo)樣無(wú)內(nèi)標(biāo)物）

圖3 空白氣相色譜圖（甾烯醇微乳劑樣品，無(wú)內(nèi)標(biāo)物）

圖4 甾烯醇母藥溶液（無(wú)內(nèi)標(biāo)物）氣相色譜圖

圖5 甾烯醇線性溶液STD1 氣相色譜圖

圖6 甾烯醇線性溶液STD5 氣相色譜圖

圖7 甾烯醇微乳劑精密度溶液ME-A1 氣相色譜圖

圖8 甾烯醇微乳劑精密度溶液ME-A5 氣相色譜圖

圖9 甾烯醇母藥精密度溶液TK-A1 氣相色譜圖

圖10 甾烯醇母藥精密度溶液TK-A5 氣相色譜圖

圖11 甾烯醇微乳劑準(zhǔn)確度溶液ME-B1 氣相色譜圖

圖12 甾烯醇微乳劑準(zhǔn)確度溶液ME-B5 氣相色譜圖

3 結(jié)論

甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比在0.178 8～2.153 9（甾烯醇質(zhì)量濃度201.2～2 424.4 mg/L），與相應(yīng)的甾烯醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，滿足定量分析要求，此氣相色譜法分析甾烯醇含量簡(jiǎn)單便捷；從甾烯醇微乳劑和母藥溶液中測(cè)定甾烯醇含量，樣品精密度和準(zhǔn)確度較好，符合分析的要求，能夠滿足檢測(cè)工作的要求，可以對(duì)甾烯醇進(jìn)行測(cè)定。