黃皮酰胺生物電子等排體AchE 抑制劑的設(shè)計(jì)合成及分子對(duì)接研究

唐敏，徐芳輝，楊吟宇，晏莉莎，鄧?guó)P君

（益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南益陽 413000）

黃皮酰胺（Clausenmaide，CLA）是從蕓香科植物黃皮（Clausenalansium）葉水浸膏中分離得到的一種吡咯烷酮類化合物[1]，有望開發(fā)成治療老年癡呆癥（Alzheimer's disease，AD）的新藥[2-5]，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。CLA 化學(xué)結(jié)構(gòu)包含4 個(gè)不對(duì)稱碳原子，即8對(duì)對(duì)映體。其中(-)-CLA 和(+)-CLA 絕對(duì)構(gòu)型分別為：3S，4R，5R，6S 和3R，4S，5S，6R。(-)-CLA結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)疏水苯環(huán)且疏水性較強(qiáng)，使其容易進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并通過血腦屏障發(fā)揮作用。研究表明，(-)-CLA 可以拮抗Aβ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞神經(jīng)毒性和增強(qiáng)的基底突觸傳遞[6]，可改善失憶癥動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)和記憶[2,7]。目前，(-)-CLA 已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，正在準(zhǔn)備Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

圖1 黃皮酰胺結(jié)構(gòu)

(-)-CLA 具有良好的促智作用，但(+)-CLA 沒有促智作用[8]，表明黃皮酰胺的藥理作用存在手性選擇性。(-)-CLA 黃皮酰胺能改善樟柳堿所致的記憶障礙，這與其逆轉(zhuǎn)樟柳堿引起的腦內(nèi)乙酰膽堿含量降低作用相關(guān)[9]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)CLA 的抑制AchE 作用也存在手性選擇性，(-)-CLA 作用強(qiáng)于(+)-CLA[10]。

黃皮酰胺和合成路線最早由拜爾公司設(shè)計(jì)[11]，之后中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所黃量院士設(shè)計(jì)出了黃皮酰胺的仿生合成路線[12]，該法以苯甲醛和氯乙酸甲酯為原料經(jīng)Darzens 縮合、酯胺交換、氧化、環(huán)合等步驟生成外消旋黃皮酰胺酮，經(jīng)重結(jié)晶分離得到黃皮酰胺酮，再經(jīng)還原劑硼氫化鈉的作用得到黃皮酰胺。目前，化合物(-)-CLA 可以人工合成[7]，其合成技術(shù)已獲得美國(guó)專利批準(zhǔn)[6]。

黃皮酰胺是一類γ-內(nèi)酰胺環(huán)上發(fā)生多取代的2-吡咯烷酮類化合物，其結(jié)構(gòu)中可供修飾的位置較多，其中7 位羥基就是一個(gè)值得改造的位置，因?yàn)辄S皮酰胺所具有的促智和保肝作用與其7 位羥基的存在有著密切聯(lián)系。根據(jù)生物電子等排原理[13]，羥基和氨基是一對(duì)經(jīng)典的一價(jià)生物電子等排體，將黃皮酰胺7 位羥基用氨基替換后，可能得到與黃皮酰胺類似或更好藥理活性的化合物。劉卡特反應(yīng)（Leuckart-Wallach Reaction）不需要催化氫化就能一步直接將羰基轉(zhuǎn)變?yōu)榘被鵞14]。該法原料易得，不需特殊設(shè)備，產(chǎn)品質(zhì)量好，產(chǎn)率較高，反應(yīng)所用的甲酸是一種可再生的還原劑，綠色環(huán)保[15]，其反應(yīng)過程見圖2。

圖2 7-羰基的劉卡特反應(yīng)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AQUITY UPLC/Q-TOF micro 質(zhì)譜，美國(guó)Waters；AVANCE-300 核磁共振氫譜，德國(guó)Bruker；Vario EL元素分析儀，德國(guó)Elementar；JA1203 電子天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；X6 型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，北京泰克儀器有限公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限公司。

甲酸，分析純，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；氧化苯乙烯，分析純，上海乙基化工有限供公司。的黃皮酰胺仿生合成路線合成[12]。

(±)-3-羥基-4-苯基-5-(甲酰氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮的合成，在裝有溫度計(jì)、冷凝管、磁力攪拌裝置的50 mL 三頸瓶中加入黃皮酰胺酮

1.2 目標(biāo)化合物的合成

原料化合物3-羥基-4-苯基-5-苯甲酰基-N-甲基-γ-內(nèi)酰胺（黃皮酰胺酮）按照黃量院士設(shè)計(jì)0.296 g（0.001 mol）、0.1 g MgCl2·H2O，加入2 mL甲酰胺（0.05 mol)、1mL 甲酸攪拌溶解，緩慢升溫至130 ℃攪拌反應(yīng)，TLC（硅膠GF254，乙酸乙酯∶石油醚=4 ∶1，紫外燈（UV）下觀察）跟蹤，1 h 后升溫至165 ℃，反應(yīng)5 h 后原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液中加入20 mL 蒸餾水?dāng)嚢?0 min，然后用3×10 mL 二氯甲烷萃取水相，收集有機(jī)相，依次用4×50 mL 水、3×30 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、2×30 mL 飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥過夜，濾過，濾液減壓蒸干得白色固體，乙酸乙酯重結(jié)晶得白色片狀結(jié)晶0.203 g，產(chǎn)率63.7%，熔點(diǎn)（mp）212.3～213.2 ℃。

(±)-3-羥基-4-苯基-5-(氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮的合成，在裝有溫度計(jì)、冷凝管、磁力攪拌裝置的50 mL 三頸瓶中加入(±)-3-羥基-4-苯基-5-(甲酰氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮0.324 g（0.001 mol）加入5 mL 無水乙醇溶解后，滴加濃鹽酸0.15 mL，80 ℃條件下回流4 h 后出現(xiàn)白色沉淀，抽濾，濾渣用無水乙醇洗滌至中性后溶解于10 mL 蒸餾水中，過濾，往澄清溶液中加入20% NaOH溶液，調(diào)pH 至中性，析出沉淀，濾過，濾餅用乙酸乙酯重結(jié)晶得片狀結(jié)晶0.207 g，產(chǎn)率68.5%，mp 195.8～196.5 ℃。

1.3 分子對(duì)接

從Protein Data Bank（PDB 庫(kù)，http://www.rcsb.org）下載與多奈哌齊復(fù)合的乙酰膽堿酯酶（PDB ID：1EVE）的晶體結(jié)構(gòu)[16]。本研究采用SYBYL-X 2.0 分子模擬軟件，將復(fù)合物中的小分子配體抽離，刪去水分子，生成結(jié)合口袋。隨后進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化、分子-配體對(duì)接以及相關(guān)評(píng)價(jià)。分子三維結(jié)構(gòu)顯示采用Chemdraw3D 軟件，二維結(jié)構(gòu)展示采用Chemdraw2D 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

質(zhì)譜、核磁共振氫譜、元素分析等數(shù)據(jù)與目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)一致，證實(shí)所得化合物結(jié)構(gòu)正確。

(±)-3-羥基-4-苯基-5-（甲酰氨基）芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮，m/z 325.15；元素分析（C）70.20、（H）6.21、（N）8.47；1H-NMR：2.841（s，3H，N-CH3），3.020（t，J=7.5 Hz，1H，C4-H），3.945（dd，J=7 Hz，1H，C3-H），4.072（dd，J=7 Hz，1H，C5-H），5.560（dd，J=10 Hz，1H，C7-H），5.936（d，J=4.5 Hz，1H，C3-OH，D2O 交換后消失），6.860～7.210（m，10H，Ar-H），8.248（s，1H，C8-H），8.831（d，J=10 Hz，1H，NH，D2O 交換后消失）。

（±）-3-羥基-4-苯基-5-（氨基）芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮，m/z297.16；元素分析（C）72.98、（H）6.72、（N）9.30；1H-NMR：2.089（br，2H，NH2，D2O 交換后消失），2.907（s，3H，N-CH3），3.007（t，J=5.0 Hz，1H，C4-H），3.764（dd，J=5 Hz，1H，C3-H），3.798（d，J=5 Hz，1H，C5-H），4.379（d，J=3.0 Hz，1H，C7-H），6.00（br，1H，C3-OH，D2O 交換后消失），6.753-7.314（m，10H，Ar-H）。

2.2 分子模擬對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接打分結(jié)果見表1?？煽啃则?yàn)證結(jié)果顯示，乙酰膽堿酯酶（PDB ID：1EVE）原配體多奈哌齊重新對(duì)接后發(fā)現(xiàn)其結(jié)合位置與原受體結(jié)晶中的配體位置幾乎重疊，總得分（Total score）值為4.573 3。表明該對(duì)接實(shí)驗(yàn)所選用的蛋白晶體結(jié)構(gòu)及所采用的對(duì)接方法均可靠，可用于黃皮酰胺類似物乙酰膽堿酯酶抑制活性的虛擬篩選。(-)-CLA 與乙酰膽堿酯酶結(jié)合對(duì)接效果強(qiáng)于(+)-CLA，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的結(jié)果一致。(-)-3-羥基-4-苯基-5-(α-氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮Total score 高達(dá)6.092 1，超過了多奈哌齊的打分，(+)-3-羥基-4-苯基-5-(β-氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮的打分為4.572 3，與多奈哌齊的打分非常接近。分子對(duì)接相互作用模式圖見圖3。

表1 分子對(duì)接結(jié)果

3 結(jié)論

圖3 分子對(duì)接相互作用模式圖

從已有黃皮酰胺抑制乙酰膽堿酯酶的生物活性出發(fā)，通過生物電子等排原理及Leuckart-Wallach 反應(yīng)將3-羥基-4-苯基-5-苯甲?；?N-甲基-γ-內(nèi)酰胺6 位上的羰基改造成氨基，以期開發(fā)出活性更好的乙酰膽堿酯酶抑制劑。同時(shí)基于結(jié)構(gòu)的配體設(shè)計(jì)原理，通過分子對(duì)接試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物3-羥基-4- 苯基-5-(β- 氨基) 芐基-N- 甲基-2- 吡咯烷酮與乙酰膽堿酯酶1EVE 對(duì)接效果較好。但Leuckart-Wallach 反應(yīng)生成的胺類化合物為消旋體，其分離工作有待進(jìn)一步的研究，此外通過分離得到的單體化合物還需要進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性抑制試驗(yàn)確證。