柚子皮揮發(fā)油減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用

田鑫悅 謝露 王文艷 鄒鑫森 趙高陽 袁張莉 莫燕資 張波 陳蒙華*

缺血性腦卒中是由于腦血管堵塞導(dǎo)致腦組織血流供應(yīng)中斷，使該血管所供應(yīng)的腦組織出現(xiàn)缺血、缺氧和能量衰竭而導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡的腦部疾病。目前機(jī)械取栓及溶栓等治療均可恢復(fù)缺血組織血液供應(yīng)，但隨之會(huì)導(dǎo)致腦梗死面積進(jìn)一步擴(kuò)大，損傷加重，稱之為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。CIRI 會(huì)引起免疫系統(tǒng)激活，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)加重?fù)p傷。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞作為抵抗腦缺血損傷的第一道防線，與CIRI 密切相關(guān)。柚子皮揮發(fā)油（pom?elo peel volatile oil，PPVO）是將柚子皮以蒸餾形式獲得的提取物，柚子皮提取物具有抗氧化，抗炎抑菌，抗病毒和抗黑色素生成多種生物活性，且已被證實(shí)可在短暫性全腦缺血模型中預(yù)防缺血性腦損傷［1，2］。本研究擬通過大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后的病理表現(xiàn)以及腦常駐膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)一步探索PPVO 的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 柚子皮揮發(fā)油的制備PPVO 取材自2019年9 月從廣西壯族自治區(qū)容縣沙田村采集的成熟柚子新鮮果皮（Cirtrus grandis（L.）Osbeck var.shatinyu Hort）。柚皮經(jīng)純水洗滌后，除去果肉和白色果皮，得到最外層富含油胞的黃色柚皮，并切成1.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 的小塊放在入無菌容器中，并使用蒸餾器通過冷卻系統(tǒng)蒸餾，2 h 后將水和PPVO 分離，300 μL 柚子皮揮發(fā)油是由150 g 柚子皮經(jīng)3 次蒸餾富集所得，所得PPVO 置于4℃環(huán)境保存。

1.2 儀器與試劑TTC 購于美國Sigma 公司。線栓購于中國廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。甲苯胺藍(lán)溶液、蘇木精溶液、伊紅溶液均購于中國Solarbio公司。光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。兔多克隆抗GFAP 抗體（1∶50，萬類生物，中國，#wl0836），兔單克隆抗Iba 1 抗體（1∶50，CST，美國，#17198）。二抗（1∶500，GB23301）、BSA 均購于中國Servicebio公司。

1.3 動(dòng)物模型制備（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選取健康成年Sprague?Dawley（SD）大鼠40 只，6-8 周齡，220-250 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。包括動(dòng)物在內(nèi)的所有程序均已得到動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)和廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及局灶性腦缺血再灌注損傷模型建立大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組（n=8/組），分別為：假手術(shù)（SH）組，模型（NS）組（2 mL/kg），甘油溶劑組（GL）組（10%甘油，2 mL/kg），低劑量（LP）組（10 mg/kg）和高劑量（HP）組（30 mg/kg）。PPVO 溶解在10%甘油中使用，所有藥物均經(jīng)腹腔注射給藥。SH 組大鼠給予分離頸總及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，但不阻塞大腦中動(dòng)脈。所有大鼠術(shù)前12 h 禁食，可自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mg/kg）將大鼠麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)板上。短暫性大腦中動(dòng)脈堵塞/再灌注（transient middle cerebral artery occlu?sion/reperfusion，tMCAO/R）手術(shù)操作參照既往文獻(xiàn)描述并稍加修改［3］。簡而言之，手術(shù)區(qū)備皮、消毒，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA），于ICA 和ECA 分叉處結(jié)扎ECA。將線栓（L3200?3400）通過CCA 的小切口插入，并沿ICA 管腔進(jìn)一步推動(dòng)直至感覺到阻力，此時(shí)線栓硅膠部距分叉處約18-20 mm。最后縫合皮膚切口，并對切口處皮膚進(jìn)行消毒。閉塞2 h后，將線栓輕輕取出，恢復(fù)腦血流灌注，并于再灌注時(shí)立即腹腔注射藥物。在整個(gè)手術(shù)過程中，使用加熱燈將直腸溫度維持在（37.0±0.5）℃。大鼠從麻醉中恢復(fù)后可以自由進(jìn)食飲水。

1.4 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分（neural defect score，NDS）由一位觀察者對所有大鼠于tMCAO/R 后24 h，以Longa 評(píng)分作為參照進(jìn)行獨(dú)立盲評(píng)：無神經(jīng)功能缺損（0 分）；屈曲，內(nèi)收和無法完全伸展的大鼠右前肢（1 分）；走路時(shí)向右轉(zhuǎn)（2 分）；向右傾倒（3 分）；昏迷或無法自發(fā)行走（4 分）。

1.5 2，3，5?氯化三苯基四氮唑（2，3，5?triphenyl?tetrazolium chloride，TTC）染色大鼠于tMCAO/R后24 h 深度麻醉后處死（n=3/組），在1 分鐘內(nèi)迅速取出大腦并在-20℃冷凍10 分鐘后，切為2 mm 厚度冠狀腦片，置于37℃的黑暗環(huán)境，用1%TTC 染液正反面染色各20 min，經(jīng)4%多聚甲醛固定4h取出，用數(shù)字?jǐn)z影記錄切片，并使用Image J 軟件測量梗塞體積。根據(jù)以下公式計(jì)算梗塞體積的百分比：（測得的梗塞面積?水腫面積）/（全腦面積?水腫面積），其中（患側(cè)半球面積?對側(cè)半球面積）為水腫面積。

1.6 石蠟切片制備大鼠于tMCAO/R 后24 h 深度麻醉后處死（n=5/組），將SD 大鼠深度麻醉后，經(jīng)主動(dòng)脈用4℃預(yù)冷的生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h。梯度乙醇脫水后石蠟包埋。石蠟塊制成5 μm 厚度切片用于尼氏染色以及3 μm 厚度切片用于蘇木素?伊紅（Hematoxylin?eosin，HE）染色和免疫熒光（immunofluorescence，IF）染色。（1）尼氏染色切片脫蠟脫水，經(jīng)甲苯胺藍(lán)溶液中染色30 min，分化液分化后，置于蘇木精溶液中染色1 min，常規(guī)干燥封片。光學(xué)顯微鏡400 倍鏡下觀察，每張切片均定位至大腦皮層五個(gè)隨機(jī)的不同區(qū)域，計(jì)數(shù)富含尼氏體的神經(jīng)元，并取其均值。尼氏小體在病理?xiàng)l件下可能溶解并消失。（2）HE 染色切片脫蠟脫水，蘇木精溶液染色5 min，鹽酸乙醇染色3 s，后置于伊紅染液中1 min，常規(guī)干燥封片。光學(xué)顯微鏡400 倍鏡下觀察并收集圖像。（3）IF 染色切片脫蠟脫水，在EDTA 抗原修復(fù)緩沖液（PH 8.0）中高壓修復(fù)，滴加BSA 封閉30 min 后滴加一抗：兔多克隆抗GFAP 抗體、兔單克隆抗Iba 1 抗體，并置于4℃孵育過夜。滴加二抗置于在25℃下孵育50 min。將切片與DAPI 染料溶液在室溫黑暗環(huán)境下孵育10 min。PBS 沖洗后，用抗熒光淬滅密封劑封片。熒光顯微鏡400 倍鏡下觀察，每張切片均定位至大腦皮層半暗帶，并隨機(jī)定位在1 個(gè)區(qū)域上收集圖形并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率=GFAP 或Iba 1 陽性細(xì)胞數(shù)目/DAPI 染色的細(xì)胞核總數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較LSD?t 檢驗(yàn)比較，若非正態(tài)分布或者方差不齊，使用Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)方法進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分見表1。

表1 PPVO 對大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、梗死面積以及存活神經(jīng)元數(shù)目的影響

2.2 TTC染色見圖1。

圖1 各組大鼠腦TTC 染色結(jié)果

2.3 尼氏染色見圖2。

圖2 各組大鼠尼式染色結(jié)果

2.4 HE 染色見圖3。

圖3 各組大鼠HE 染色結(jié)果

2.5 IF 染色見圖4。

圖4 各組大鼠GFAP 和Iba 1 免疫熒光染色結(jié)果

3 討 論

早期干預(yù)可以通過減輕CIRI，減輕缺血性卒中的致殘率和死亡率，促進(jìn)卒中患者早日康復(fù)。在本研究病理及膠質(zhì)細(xì)胞染色表明：PPVO（30 mg/kg）可以明顯減小梗死面積，改善神經(jīng)功能缺損和病理損傷，同時(shí)還可以抑制半暗帶星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中兩種主要的膠質(zhì)細(xì)胞，在腦組織受損時(shí)，發(fā)揮先天性免疫細(xì)胞作用，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最大的膠質(zhì)細(xì)胞，在正常生理狀態(tài)下，參與調(diào)節(jié)突觸活性，調(diào)節(jié)水和離子穩(wěn)態(tài)，提供營養(yǎng)，清除有毒代謝產(chǎn)物以及參與形成血腦屏障等作用，且本研究發(fā)現(xiàn)，CIRI 后星形膠質(zhì)細(xì)胞在半暗帶大量激活。Nowicka 等［4］研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在發(fā)病后4 小時(shí)-1 天開始，并在4天達(dá)到峰值，并在大鼠中持續(xù)到28 天。星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血和再灌注損傷刺激下，迅速增殖和瘢痕形成，釋放炎癥因子，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。且其作為血腦屏障（blood?brain barrier BBB）的重要組成部分，激活后形態(tài)腫脹，增加BBB 滲透性，促進(jìn)血源性炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞）浸潤至損傷區(qū)域，從而進(jìn)一步加重神經(jīng)元損傷。已知GFAP 作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，其表達(dá)增加代表星形膠質(zhì)細(xì)胞的增加。與本研究結(jié)果一致，有研究也證實(shí)GFAP 腦缺血后半暗帶中表達(dá)明顯增多，與神經(jīng)元受損程度有關(guān)［5］。

小膠質(zhì)細(xì)胞占神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的5%-20%，作為大腦固有的先天性免疫細(xì)胞，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的宿主防御功能。Iba 1 是小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物，在損傷后腦組織中表達(dá)上調(diào)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活是急性腦損傷后炎癥反應(yīng)的第一步，并于缺血后2-3 分鐘開始激活，并在2-3 天達(dá)到峰值，以釋放破壞性促炎性介質(zhì)為特征，導(dǎo)致半暗帶區(qū)域的二次死亡［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活與腦損傷程度相關(guān)，且在再灌注24 h 后，小膠質(zhì)細(xì)胞雖然激活明顯增加，但其激活程度低于星形膠質(zhì)細(xì)胞。給予PPVO 可抑制兩者激活，其機(jī)制可能通過減輕免疫炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。據(jù)前期對沙田柚的PPVO 成分分析可知，檸檬烯、β?月桂烯是PPVO 中含量最高的成分，且檸檬烯和月桂烯均已證實(shí)具有抗炎活性，因此我們推斷PPVO 可能通過抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［7］。

綜上所述，本研究采用的tMCAO/R 模型在一定程度上模擬了臨床上CIRI 的病理生理過程，并且證實(shí)了再灌注早期給予PPVO 可以降低缺血性腦卒中的損傷并抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。但PPVO 為多種活性成分的混合物，其腦保護(hù)作用可能是多靶點(diǎn)協(xié)同作用，具體的單體成分的相關(guān)活性及具體的保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。