促紅細胞生成素對離體幼兔缺血再灌注心肌中PI3K-Akt信號通路的影響

王文生，馬洪亮，高洋

（中國醫(yī)科大學 附屬盛京醫(yī)院心臟外科，沈陽 110004）

心肌缺血再灌注損傷雖然是臨床實踐中常見的組織器官損傷，但其準確機制仍不十分清楚。研究表明多種生長因子對心臟有保護作用，使其免受局部缺血及其再灌注損傷帶來的損害。雖然這些心肌保護因子的轉導通路很復雜，但在很多情況下，抗細胞凋亡是它們的一個共同特征［1］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）-蛋白激酶 B（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog，AKT）信號轉導途徑是細胞內(nèi)重要的信號轉導通路，在細胞的凋亡、存活、增殖以及細胞骨架的變化等活動中發(fā)揮重要的生物學功能，其中尤為重要的是它對細胞凋亡、存活的調(diào)節(jié)作用［2］。近年來，對缺血/再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷機制的研究日益深入，對未成熟心肌保護的認識進一步加深，提出了一些新的保護策略。其中，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）的心肌保護作用引起了人們的關注［3］。本研究在初步觀察EPO預處理可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷、對未成熟心肌具有一定的心肌保護作用及用量以EPO 5 000 U/kg效果最顯著的基礎上［4］，采用免疫組化和TUNNEL等方法進一步探討EPO對未成熟心肌缺血再灌注損傷保護作用與PI3K-AKT信號轉導途徑的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

出生14～21 d的日本長耳大白兔30只（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物室提供），體質量230～300 g，雌雄不拘。30只日本大耳白幼兔隨機數(shù)字表法分為對照組與EPO預處理組，每組15只。在模型建立前24 h，EPO預處理組經(jīng)腹腔注射EPO（5 000 U/kg，沈陽三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），對照組經(jīng)腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2 動物模型的建立

實驗動物腹腔注射10%烏拉坦（10 ml/kg）麻醉，腹腔注射肝素鈉（500 U/kg）抗凝。迅速取出心臟，經(jīng)主動脈插管后，連接于灌注裝置上，建立Langendorff幼兔離體心臟灌注模型。主動脈根部灌注37℃、95%O2+5%CO2混合氣持續(xù)氧合的K-H緩沖液，壓力7.98 kPa。經(jīng)15 min的自然灌流平衡后，實驗組及對照組分別用4℃心臟停搏液進行停搏。停搏30 min后，以37℃K-H液再灌注120 min。取再灌注120 min的左室心肌進行相關檢測。

1.3 檢測方法和觀察指標

1.3.1 免疫組化法觀察心肌組織PI3K、AKT及caspase 9表達情況：PI3K、AKT及caspase 9表達均為胞質染色，陽性者染成黃色或者棕黃色，陰性者不被染色，表達越強染色越深。應用Imagepro-Plus軟件進行各個標本的平均光密度檢測。

1.3.2 TUNNEL法檢測細胞凋亡：凋亡細胞的核呈棕色或棕褐色著染細胞核形態(tài)呈碎點狀，不規(guī)整，大小不一致，而正常非凋亡細胞核被蘇木素復染呈藍色，核相對較大，形態(tài)大小較為一致，在物鏡（40×）下計算陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，選擇細胞總數(shù)200以上的視野，每個標本觀察4張切片，取平均值，以心肌凋亡陽性細胞數(shù)占總心肌細胞數(shù)的百分比作為心肌細胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，組間比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較用多重比較t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PI3K、AKT及caspase 9的心肌組織含量表達

心肌缺血再灌注120 min后，EPO組PI3K和AKT的心肌組織含量表達明顯高于對照組（圖1、圖2），EPO組caspase 9的心肌組織含量則明顯低于對照組（圖3）。各免疫組化結果的平均灰密度值，EPO組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1。

表1 兩組心肌缺血再灌注2 h后PI3K、AKT及caspase 9表達的比較（±s）Tab.1 Comparison of PI3K，AKT and caspase9 expression in ischemia-reperfusion myocardiac cells at 2 h after reperfusion（±s）

表1 兩組心肌缺血再灌注2 h后PI3K、AKT及caspase 9表達的比較（±s）Tab.1 Comparison of PI3K，AKT and caspase9 expression in ischemia-reperfusion myocardiac cells at 2 h after reperfusion（±s）

1）P<0.01 vs control group.

Group n PI3K AKT Caspase-9 Control group 15 0.2687±0.0117 0.2384±0.0053 0.4334±0.0064 EPO-treated group 15 0.4138±0.00941） 0.4021±0.01361） 0.2449±0.01101）

2.2 心肌組織凋亡細胞的表達

心肌缺血再灌注120 min后，EPO組心肌組織凋亡細胞的數(shù)量明顯低于對照組（圖4）。心肌細胞凋亡指數(shù) EPO 組（9.9±2.1）與對照組（15.9±1.5）比較存在統(tǒng)計學差異（P<0.01）。

3 討論

研究結果［5］表明很多心肌缺血再灌注損傷保護方式都是通過激活了PI3K-Akt信號通路，從而抑制細胞凋亡，促進血管形成等作用而產(chǎn)生的。在PI3K家族中，IA型PI3K和其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt（或PKB）所組成的信號通路因其調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、存活和遷移等作用及與心肌保護發(fā)生發(fā)展的相關性，近年來備受矚目。Kennedy等［6］發(fā)現(xiàn)，在血清撤離后，即使活化的 Ras、Raf和Src也不能完全傳遞存活信號，相反，PI3K活性的抑制能促進凋亡，而活化的AKT則能阻斷凋亡。很多研究者在離體心臟模型試驗中發(fā)現(xiàn)［7，8］，在再灌注初期加入PI3K的抑制劑wortmannin可以抵消缺血后處理的心肌保護作用?；罨腁kt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase 9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等，進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。Akt的激活不僅降低在體缺血再灌注模型中心肌細胞的死亡率，而且能真正地改善心肌局部和整體的功能。對細胞收縮和鈣轉運的測量說明心肌細胞Akt的激活在體外能保護心肌細胞免受缺氧誘導的功能障礙。Caspase是細胞凋亡的啟動者和效應器，AKT能夠磷酸化caspase 9使之失去其蛋白水解酶的活性，并進一步抑制 caspase 9 下游分子包括 caspase 2，3，6，8，10引起的一系列的串聯(lián)反應進而抗細胞凋亡［9］。

EPO是一種刺激骨髓造血的糖蛋白類激素，主要是由腎皮質和髓質交界處的球旁細胞合成，分子量為30.4 kDa，其主要作用為促紅系祖細胞分化及分裂為成熟紅細胞，已廣泛用于治療腎衰竭，化療及外科手術等多種原因所造成的貧血。研究證實EPO受體（erythropoietin receptor，EPOR）廣泛分布于心血管系統(tǒng)，因此EPO在心血管系統(tǒng)中有著造血以外的多種生物作用［10］，近年來隨著研究的深入，其心肌保護作用逐漸受到關注。研究表明［10］EPO預處理在心肌缺血再灌注損傷中具有顯著的抗凋亡效應；這一效應與其上調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達有關，而bcl-2是第一個被直接證實的PI3-K-Akt/PKB信號轉導途徑下游調(diào)節(jié)細胞凋亡及存活的靶基因，故EPO預處理在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用可能與PI3K-AKT信號轉導途徑的抗凋亡作用有關。

本次研究再次選用幼兔離體心臟缺血再灌注模型，排除了在體心臟受神經(jīng)、體液等多種因素的影響，從而觀察藥物對心臟的作用。實驗結果顯示：給予EPO預處理，可顯著提高缺血再灌注120 min后的心肌組織PI3K及AKT表達，并顯著降低缺血再灌注120 min后心肌組織caspase 9的表達。表明EPO預處理可能通過激活PI3K/AKT通路，激活PI3K，活化AKT的表達，進而抑制凋亡相關基因caspase 9的表達，減少心肌細胞凋亡，從而對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用。另外，本實驗與對照組相比，EPO預處理組缺血再灌注120 min后的心肌凋亡細胞明顯較少，進一步證實了EPO預處理可能是通過抗細胞凋亡來起到對缺血再灌注心肌的保護作用的。

［1］Abe J，Baines CP，Berk BC.Role of mitogen-activated protein kinases inischemiaandreperfusioninjury：thegoodandthebad［J］.CircRes，2000，86（6）：692-699.

［2］孫曉杰，黃常志.PI3K-Akt信號通路與腫瘤［J］.世界華人消化雜志，2006，14（3）：306-311.

［3］Hirata A，Minanino T，Asanuma H，et al.Erythropoietin enhances neovascularization of ischemic myocardium and improves left ventricular dysfunction after myocardial infarction in dogs［J］.J Am Coll Cardiol，2006，4：176-184.

［4］王文生，高洋，馬洪亮.促紅細胞生成素對幼兔心肌缺血再灌注損傷的實驗研究［J］.中國醫(yī)科大學學報，2009，38（6）：431-433.

［5］Matsui T，Nagoshi T，Rosenzweig A.Akt and PI3 kinase signaling in cardiachypertrophyandsurvival［J］.CellCycle，2003，2（3）：220-223.

［6］Kennedy SG，Wagner AJ，Conzen SD，et a1.The PI3-kinase／Akt sig－nalingpathwaydeliversananti-apoptoticsignal［J］.Genes Dev，1997，11（6）：701-713.

［7］Tsang A，Hauseuloy DJ，Moeanu MM，et al.Posteonditioning：a form of“modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol3-kinase-Aktpathway［J］.Circ Res，2004，95（3）：230-232.

［8］周春燕，陳玉培.PI3K／AKT信號通路在異丙酚減輕離體大鼠心臟缺血再灌注損傷中的作用［J］.中華麻醉學雜志，2007，27（2）：151-155

［9］Zhou HL，Li XM，Meinkoth J，et al.Akt regulates cell survival and apoptosis at a postmitochondrial level［J］.J Cell Biol，2000，151（3）：483-494.

［10］Ruifrok WP，de Boer RA，Westenbrink BD，et al.Erythropoietin in cardiac disease：New features of an old drug［J］.Eur J Pharmacol，2008，585（2-3）：270-277.

［11］Mudalagiri NR，Mocanu MM，Di Salvo C，et al.Erythropoietin protects the human myocardium against hypoxia-deoxygenating injury via phosphatidylinositol-3 kinas and ERK1/2 activation ［J］.Br J Pharmacology，2008，153（1）：50-56.