城市生活垃圾堆放對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響

程智超，吳文彥，宋永輝，隋 心，李夢莎，楊立賓

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040）

0 引言

1979年以來，中國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、中國城市規(guī)模越來越大、城市人口和面積也逐漸增加，由此而導(dǎo)致的城市生活垃圾也呈現(xiàn)迅猛增長的勢頭，目前已經(jīng)成為中國城市發(fā)展中的一個(gè)嚴(yán)重問題[1]。哈爾濱市是東北地區(qū)的重要城市之一，人口增長和城市化進(jìn)程也十分迅速，自1990年垃圾產(chǎn)量年遞增較快，其城市生活垃圾產(chǎn)量也呈現(xiàn)爆炸性增加。目前，哈爾濱市處理生活垃圾的方法受技術(shù)條件限制，仍以簡單填埋或直接堆放為主，而垃圾堆放過程中由于其分解緩慢，在分解過程中會(huì)產(chǎn)生含有大量有害物質(zhì)、例如有機(jī)污染物、重金屬、致病細(xì)菌等，對土壤和周圍環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[2]。土壤細(xì)菌是生態(tài)系統(tǒng)中的主要分解者[3]，對于城鎮(zhèn)生活垃圾的降解具有十分重要的作用，垃圾在土壤細(xì)菌的作用下，經(jīng)過復(fù)雜的分解、吸收、轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將垃圾分解成無機(jī)物質(zhì)[4]。因此，探究生活垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成和多樣性，對評(píng)估垃圾堆放對環(huán)境的影響以及恢復(fù)垃圾污染造成的土壤污染具有重要意義。

目前針對城市生活垃圾的研究主要集中在垃圾堆放后對土壤理化性質(zhì)[5]和對土壤重金屬污染[6]。例如，張青青等[7]研究發(fā)現(xiàn)垃圾長期堆放導(dǎo)致土壤pH降低，而土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷、速效鉀增加；旦增等[8]通過對西藏班戈縣垃圾填埋場土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)估發(fā)現(xiàn)，垃圾場周邊土壤重金屬含量顯著升高。而針對生活垃圾堆放對土壤微生物的研究，國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了一些研究，例如，Tan等[9]對厭氧污泥土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了研究；張子赟[10]對安徽合肥市垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。黑龍江省屬于高寒地區(qū)，由于積溫少、冬季漫長，垃圾分解緩慢，土壤微生物結(jié)構(gòu)、多樣性和功能均和暖溫帶地區(qū)有顯著差異。然而，針對于東北地區(qū)，尤其是高寒地區(qū)生活垃圾堆放條件下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究一直沒有進(jìn)行深入闡明。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是二代高通量測序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用，利用高通量測序技術(shù)，不僅可以準(zhǔn)確的揭示出土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，而且還可以對其功能進(jìn)行預(yù)測分析[11-12]。

因此，揭示黑龍江省哈爾濱市長期生活垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響就顯得尤為重要。本研究中，筆者以哈爾濱市生活垃圾堆放出的土壤和相鄰未污染土壤為研究對象，利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，以期揭示高寒地區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對于生活垃圾長期堆放的變化規(guī)律，以期為合理處理生活垃圾以及土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

采樣地點(diǎn)位于黑龍江省哈爾濱市雙城區(qū)億豐生活垃圾處理廠的核心堆放區(qū)，該區(qū)域面積為70000 m2。該地區(qū)屬于溫帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為5.1℃，年平均降水量約為569.1 mm，年日照時(shí)數(shù)約2580 h，年平均無霜期139天，平均相對濕度64%；該地區(qū)土壤類型為典型東北黑土。

1.2 樣品采集

在億豐生活垃圾處理廠選擇長期堆放的土壤區(qū)域，于2020年5月進(jìn)行取樣。按照5點(diǎn)采樣法選擇3個(gè)10 m×10 m規(guī)格的樣方，除去土壤表面垃圾物和表層土，用土鉆鉆取距離表層約0～20 cm處的土壤，將5個(gè)土樣混合均勻取1 kg裝入無菌自封袋，作為處理組(T)；同時(shí)在垃圾堆周圍50 m處，在未堆放垃圾作為空白對照，同樣用土鉆隨機(jī)鉆取5個(gè)0～20 cm處的土壤混合均勻取1 kg裝入無菌自封袋，作為對照組(C)，然后立即放入低溫保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室后過2 mm篩處理，然后置于-80℃冰箱中用于后續(xù)分析。

1.3 土壤總DNA的提取和高通量測序

土壤基因組DNA采用Fast DNA?Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，U.S.A)試劑盒進(jìn)行提取，具體方法參照使用說明。提取完的土壤基因組DNA用NanoDrop2000進(jìn)行檢測。高通量測序引物采用338F和806R對細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

DNA 1 μL、引物1 μL、PCR Reaction Mix 12.5 μL，總體積為25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min、30個(gè)循環(huán)(95℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 1 min)，最后72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，然后PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)測序數(shù)據(jù)

測序數(shù)據(jù)采用QIIME軟件進(jìn)行處理，雙端序列使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)量控制，去除Barcode序列和引物序列后，用FLASH軟件拼接和過濾，用usearch軟件去除嵌合體，獲得有效序列；使用UPARSE軟件(v7.0.1090)在97%的相似度下對有效序列進(jìn)行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析將優(yōu)化序列根據(jù)Silva庫中的參考序列對OTU進(jìn)行種屬鑒定，最后獲得OTU表。Alpha多樣性指數(shù)（Chao和 ACE、Shannon和 Simpson）使用Mothur(v.1.30.2)進(jìn)行計(jì)算。功能分析使用PICRUSt(v2.0.0)軟件在線分析完成。Venn圖、物種豐度圖等用R實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

對無生活垃圾覆蓋(C)和有生活垃圾覆蓋(T)處理的土壤細(xì)菌16S rRNA基因序列的V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測序，分別得到113294和106606條序列，在剔除引物、低質(zhì)量序列后，分別得到85435和76432條有效序列。對有效序列基于97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，處理組和對照組一共得到4579個(gè)有效的OTU，分別為2538和2041個(gè)；在門水平得到53個(gè)分類單元，2個(gè)處理分別為52和52個(gè)；在屬水平得到586個(gè)分類單元，2個(gè)處理分別為559和484個(gè)。

2.2 土壤細(xì)菌多樣性

2個(gè)處理的土壤細(xì)菌Alpha多樣性結(jié)果見表1。由表1可知，處理組的Chao1和ACE指數(shù)均比對照組低14.47%和15.01%，無生活垃圾覆蓋的土壤細(xì)菌具有更高的豐富度；處理組的Shannon指數(shù)低于對照組6.45%，而Simpson指數(shù)高于對照組，沒有生活垃圾覆蓋的土壤物種多樣性更高。2組樣本的測序覆蓋率均在98%以上，說明取樣合理，測序數(shù)據(jù)能夠真實(shí)反映土壤樣品中的微生物群落。

表1 土壤樣品的微生物多樣性指數(shù)

2.3 土壤細(xì)菌組成土壤細(xì)菌群落組成

2個(gè)處理的土壤細(xì)菌群落組成見圖1和2。分析結(jié)果表明：在門水平，處理組與對照組的土壤細(xì)菌組成非常相似，相對豐度均以變形菌門(Proteobacteria)為最高，在2處理中分別為40.3%和42.6%，其次依次為擬桿菌門(Bacteroidetes)(21.7%、9.1%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(5.9%、12.9%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(7.3%、7.3%)、放線菌門(Actinobacteria)(4.2%、3.8%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(2.3%、3.9%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)(5.0%、1.0%)、Ignavibacteriae(2.0%、3.3%)（圖1）。相較于對照組，處理組中變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、Ignavibacteriae的相對豐度增加，其中綠彎菌門增加幅度最大，為7.0%；而擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門等相對豐度減少，其中擬桿菌門減少幅度最大，為12.6%。

圖1 不同處理土壤樣品在門分類水平上細(xì)菌組成

在屬水平上，2組處理均以黃單胞菌科的相對豐度最高，分別為5.1%和5.9%（圖2）。硫化細(xì)菌屬(Bacillus)的相對豐度最高，分別為3.1%和7.3%（圖2）。相較于對照組，處理組中硫化細(xì)菌屬(Bacillus)、厭氧繩菌屬(Anaerolineaceae)、生孢噬胞菌屬(Saprospiraceae)的相對豐度增加，分別增加4.3%、5.1%、1.4%；黃桿菌屬(Flavobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、噬纖維菌科(Cytophagaceae)的相對豐度減少，分別減少38.2%、17.3%、14.2%。

圖2 不同處理土壤樣品在屬分類水平上細(xì)菌組成

在細(xì)菌門水平上，垃圾堆放和對照土壤細(xì)菌門水平差異結(jié)構(gòu)分析見圖3A。從圖3A可以看出，與對照相比，垃圾堆放顯著提高了土壤Chloroflexi、Gemmatimonadetes、 Aminicenantes、 Parcubacteria、Spirochaetae的豐度(P＜0.05)；但是卻顯著降低了土壤Bacteroidetes、Chlorobi、Saccharibacteria的豐度 (P＜0.05)。

在細(xì)菌屬水平上，垃圾堆放和對照土壤細(xì)菌屬水平差異結(jié)構(gòu)分析見圖3B。與對照相比，垃圾堆放顯著提 高 了 土 壤 Desulfatiglaus、Gemmatimondaceae、Ignavibacterium、Xanthomonadales的豐度，而顯著降低了土壤Flavobacterium的豐度。

圖3 垃圾堆放對土壤細(xì)菌群落門(A)和屬(B)水平的差異分析

通過Venn圖分析2個(gè)處理土壤細(xì)菌共有的OTU數(shù)量及特有的OTU數(shù)量，共有的OTU數(shù)量有1775個(gè)，占總數(shù)的63.3%，對照組特有的屬數(shù)量有763個(gè)，占總數(shù)的27.2%，處理組特有的屬數(shù)量有266個(gè)，占總數(shù)的9.5%（圖4）。

圖4 不同處理土壤細(xì)菌在屬分類水平上的Venn圖

2.4 土壤的細(xì)菌功能性預(yù)測

通過對KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)進(jìn)行比對預(yù)測結(jié)果（表2），發(fā)現(xiàn)在KEGG一級(jí)功能層中有6個(gè)代謝通路：代謝(Metabolism)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、細(xì)胞過程(Cellular processes)、人類疾病(Human Diseases)、有機(jī)體系統(tǒng)(Organismal Systems)，其中代謝功能的占比最高，處理組中達(dá)到了10.47%，對照組為10.18%。在基因二級(jí)功能預(yù)測分析中發(fā)現(xiàn)由氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、膜運(yùn)輸(Membrane transport)、復(fù)制和修復(fù)(Replication and Repair)、能量代謝(Energy metabolism)、輔助因子和維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、類脂化合物代謝(Lipid metabolism)、核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)、信號(hào)傳導(dǎo)(Signal transduction)、類脂化合物代謝(Lipid metabolism)等41個(gè)子功能組成（表2）。相較于對照組，處理組中的膜運(yùn)輸、復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能增強(qiáng)，相對豐度分別升高0.85%、0.02%、0.43%；氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、類脂化合物代謝等功能有所降低，相對豐度分別降低0.29%、0.16%、0.11%、0.09%、0.27%。

表2 土壤細(xì)菌群落功能豐度表

續(xù)表2

3 結(jié)論

生活垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落alpha多樣性顯著降低，而且垃圾堆放改變了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成，但是土壤細(xì)菌主要的功能并未發(fā)生顯著改變，其一級(jí)代謝功能均為代謝，二級(jí)代謝功能均為氨基酸和碳水化合物代謝。因此，為降低垃圾堆放對土壤微生物的影響，還需要進(jìn)一份對生活垃圾進(jìn)行分類及無害化利用。本研究結(jié)果對于進(jìn)一步探究生活垃圾堆放對土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且對于未來合理利用生活垃圾提供理論參考。

4 討論

4.1 垃圾堆放對土壤細(xì)菌多樣性的影響

本研究通過對哈爾濱市生活垃圾處理堆放區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析發(fā)現(xiàn)，長期垃圾堆放導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落Shannon多樣性指數(shù)和Chao多樣性指數(shù)顯著降低（表1）。這與張子赟[10]的研究結(jié)果一致。這表明長期的生活垃圾堆放會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性降低，垃圾堆放過程中所產(chǎn)生的大量有機(jī)化合物、有毒物質(zhì)、重金屬、病毒、寄生蟲等會(huì)影響土壤原有細(xì)菌群落多樣性，使得土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度顯著下降，而土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度的下降會(huì)導(dǎo)致土壤質(zhì)量變差，土壤自身難以恢復(fù)到之前的原有狀態(tài)。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，垃圾長期堆放后土壤細(xì)菌多樣性和豐富度會(huì)顯著升高[13]。這說明生活垃圾堆放對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響是不同的，究其原因可能是生活垃圾含有大量廚余垃圾和含有大量營養(yǎng)元素的垃圾，這些垃圾含有細(xì)菌生長和繁殖所急需的養(yǎng)料，因此會(huì)顯著提高土壤微生物的多樣性和豐富度。而且垃圾堆放的深度[14]、生活垃圾種類[15]、堆放時(shí)間[16]、垃圾堆放區(qū)域[17]、土壤質(zhì)地[18]等均會(huì)影響土壤微生物多樣性和豐富度，因此需要從時(shí)空上對垃圾堆放對土壤微生物的影響進(jìn)行分析。

4.2 垃圾堆放對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，垃圾堆積堆放與未堆放在土壤細(xì)菌門水平組成相似，但是其相對優(yōu)勢細(xì)菌門不同。垃圾堆放土壤細(xì)菌主要以變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和酸桿菌門為主。吳雙等[19]對北京市北神樹生活垃圾填埋場的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，垃圾堆放中土壤細(xì)菌門衛(wèi)變形菌門，這也本研究的結(jié)果一致。而且，何芝等[20]對山東、廣東、上海、重慶生活垃圾堆放土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn)變形菌門是最主要的細(xì)菌門。

和未堆放生活垃圾的土壤相比，垃圾堆放顯著增加了土壤綠彎菌門、芽單胞菌門的豐度。綠彎菌是一個(gè)廣泛分布與土壤中的細(xì)菌門，其營養(yǎng)方式和代謝途徑十分豐富，參與大量元素循環(huán)和分解過程，其廣泛分布與活性污泥和堆肥等生境中[21]。芽單胞菌門是一類寡養(yǎng)土壤單胞菌，大量分布在逆境生境中，具有較強(qiáng)的分解能力[1]。本研究中，生活垃圾中含有大量的有毒重金屬等物質(zhì)，因此導(dǎo)致垃圾堆放土壤中綠彎菌門、芽單胞菌門含量增加。

在屬水平，垃圾堆放條件下，土壤中Desulfatiglaus、Gemmatimondaceae、Ignavibacterium、Xanthomonadales顯著升高。Gemmatimondaceae環(huán)境樣品中的含量豐富的細(xì)菌屬，該屬的細(xì)菌通常具有較強(qiáng)的降解纖維素能力，而且還具有重要的降解芳香族化合物和重金屬絡(luò)合物的能力，通常分布在高溫、鹽堿等逆境土壤中，通常是生活垃圾填埋場環(huán)境中的優(yōu)勢屬[22]。生活垃圾填埋條件下土壤中逆境微生物含量的增加，對于利用土壤中逆境微生物來進(jìn)行土壤修復(fù)具有十分重要的作用，這種菌屬可以為開發(fā)微生物菌劑提供了寶貴的微生物資源。但是同時(shí)筆者也發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，土壤中還含有大量未知和未分類的細(xì)菌，對于這些細(xì)菌分類和功能還需要未來進(jìn)一步的研究。

4.3 垃圾堆放對土壤細(xì)菌功能的影響

目前雖然已經(jīng)開展了一些針對于垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究[23-24]，但是針對垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌功能的研究缺仍然缺乏。本研究采用PICRUSt功能預(yù)測方式對垃圾堆放下土壤細(xì)菌功能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在一級(jí)代謝水平上，垃圾堆放和未堆放土壤細(xì)菌功能均以代謝功能為主，土壤細(xì)菌功能基因多樣性差異不大，但是在基因功能的豐度上出現(xiàn)了一定差異，未堆放組要高于堆放組。

在二級(jí)功能代謝水平上主要是氨基酸代謝(Amino Acid Metabolism)和碳水化合物代謝(Carbohydrate Metabolism)途徑，未堆放土壤高于垃圾堆放土壤0.29%和0.16%，這可能是因?yàn)樯罾逊胚^程中土壤有益細(xì)菌發(fā)生改變，主要以逆境微生物為主，因此導(dǎo)致微生物功能的降低[25]。其中垃圾堆放土壤中的優(yōu)勢菌門中變形菌門具有降解動(dòng)植物殘?bào)w、固氮及參與單碳化合物代謝等功能[26]。在垃圾堆放組的優(yōu)勢菌屬中，芽孢桿菌屬是一類主要利用單糖、雙糖、淀粉、有機(jī)酸等作為碳源和能源的細(xì)菌[27]。相較于未堆放土壤，垃圾堆放土壤細(xì)菌中膜運(yùn)輸、復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的代謝增加幅度最大。雖然本研究利用PICRUST在線預(yù)測了土壤中細(xì)菌的功能，但是由于該方法只能對已知的微生物進(jìn)行功能預(yù)測，而對于大量未知的微生物是無法進(jìn)行分析的，因此在未來需要進(jìn)一步采用宏基因組方法，更加深入的探討垃圾堆放下土壤細(xì)菌功能的改變。