產(chǎn)纖維素酶菌系的添加對(duì)厭氧干發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響

張 陳，閆紅心，紀(jì) 棟，魏志豪，姚志松，CAMARA ZOUMANA，蘇有勇

（昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，昆明 650500）

0 引言

根據(jù)英國(guó)石油公司2020年統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，2019年可再生能源消費(fèi)總量只占一次能源消費(fèi)量的4.9%，而其中的生物質(zhì)燃料消費(fèi)總量占比更微乎其微[1]。中國(guó)作為全球農(nóng)作物秸稈第一生產(chǎn)大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)2002年全國(guó)農(nóng)作物秸稈為6.2億t[2]，而2005年的產(chǎn)量增至8億t[3]。同樣的，人民生產(chǎn)消費(fèi)能力的提升也帶動(dòng)了畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，僅2015年中國(guó)僅奶牛養(yǎng)殖就有約1200萬(wàn)頭，隨之而來(lái)的是每年產(chǎn)生大量的牛糞，但利用率低[4-5]。盡管近年來(lái)政府出臺(tái)了很多限制秸稈焚燒政策，但是還有大量秸稈仍然以不同形式的形式燃燒，而燃燒所帶來(lái)的是大量的氣體污染[6-8]。農(nóng)作物秸稈和牛糞是一類含豐富纖維素類的生物質(zhì)能源，而纖維素是一種由β-D吡喃葡萄糖通過(guò)1-4糖苷鍵組成的無(wú)支鏈結(jié)構(gòu)[9]，由木質(zhì)素和半纖維素結(jié)構(gòu)包裹而很難被利用[10-11]。目前的學(xué)者大多圍繞著如何破環(huán)木質(zhì)纖維素之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)開(kāi)展相關(guān)課題，主要是圍繞著物理法，化學(xué)法和生物法或者三者之間共同作用等手段達(dá)到破壞纖維素結(jié)構(gòu)的目的。微波法是物理法常用的方法之一，Sapci Z[12]使用微波預(yù)處理秸稈，產(chǎn)氣量沒(méi)有明顯提高。而化學(xué)法通常是添加酸堿試劑、微量元素或離子液體等手段破環(huán)纖維素結(jié)構(gòu)。He等[13]添加6%的氫氧化鈉預(yù)處理水稻秸稈，使產(chǎn)氣率有所提高，而且通過(guò)處理后的樣品結(jié)構(gòu)來(lái)詳述化學(xué)試劑對(duì)秸稈處理的影響。生物法主要是酶法進(jìn)行預(yù)處理秸稈樣品，Wang等[14]通過(guò)微生物產(chǎn)生的纖維素酶預(yù)處理秸稈樣品，使沼氣產(chǎn)率提升36.9%。這些方式各有利弊：物理法和化學(xué)法作用快，但是對(duì)設(shè)備要求高且對(duì)環(huán)境不友好，而生物法作用緩慢且成本高，但是基本不會(huì)產(chǎn)生對(duì)下游工藝有害的化學(xué)物質(zhì)。相比較而言，通過(guò)向發(fā)酵體系中直接添加高產(chǎn)纖維素酶菌系能持久穩(wěn)定的降解纖維素，并可能與原發(fā)酵體系中的菌群形成物質(zhì)能量代謝平衡，以期獲得針對(duì)纖維素原料一類物質(zhì)的高產(chǎn)氣量發(fā)酵體系。并且厭氧干發(fā)酵是一種高效、環(huán)保，且對(duì)設(shè)備要求相對(duì)較低的處理方式。本試驗(yàn)通過(guò)將玉米秸稈和牛糞按照一定比例混合進(jìn)行厭氧干發(fā)酵，希望通過(guò)添加篩選得到的高效產(chǎn)纖維素酶復(fù)合菌系，從而能高效利用原料中的纖維素產(chǎn)沼氣，緩解當(dāng)前環(huán)境污染并且解決當(dāng)前能源危機(jī)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛糞收集自云南省昆明市附近養(yǎng)殖場(chǎng)，新鮮牛糞用保鮮袋封口備用；秸稈購(gòu)于江蘇東海某農(nóng)產(chǎn)品生加工廠，粉碎長(zhǎng)度在0.5 cm左右；纖維素菌株分離來(lái)源于河南牧田生物科技公司和農(nóng)富康公司；接種物取自昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與能源工程研究室的活性污泥。具體原料特性見(jiàn)表1。試驗(yàn)于2020年7—12月在中科院微生物研究所進(jìn)行。

表1 原料特性

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，Tryptone 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂15.0～20.0 g/L。

LB(Luria-Bertani)培 養(yǎng) 基 ：NaCl 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，Tryptone 10 g/L。固體培養(yǎng)基需要加瓊脂15.0～20.0 g/L。

1.3 試驗(yàn)裝置

批量發(fā)酵試驗(yàn)裝置為本實(shí)驗(yàn)室自制沼氣發(fā)酵裝置，具體裝置如圖1所示。主要分為發(fā)酵裝置和和集氣裝置組成。發(fā)酵裝置是由500 mL塑料瓶組成，瓶口連接一個(gè)放氣閥和一個(gè)導(dǎo)氣管，導(dǎo)氣管連至集氣裝置。儲(chǔ)氣采用排水集氣法，儲(chǔ)氣瓶外側(cè)粘有經(jīng)過(guò)標(biāo)定的刻度線，用作讀取產(chǎn)氣量。

圖1 批量試驗(yàn)裝置示意圖

1.4 試驗(yàn)方案

1.4.1 產(chǎn)纖維素酶菌種篩選 將所購(gòu)的產(chǎn)纖維素酶菌樣按照固液比1:10加入無(wú)菌蒸餾水，放置于30℃恒溫?fù)u床200 r/min搖勻2 h制成菌懸液。將菌懸液梯度稀釋涂布至CMC-Na初篩培養(yǎng)基，菌株長(zhǎng)出后重新再初篩培養(yǎng)基上劃線純化。將單菌落按照兩點(diǎn)法接入CMCNa培養(yǎng)基，利用剛果紅浸染法對(duì)初篩的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行復(fù)篩。根據(jù)透明圈大小選擇高產(chǎn)纖維素酶菌株構(gòu)建復(fù)合菌系。對(duì)篩得的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，利用引物27F和1492R擴(kuò)增16rDNA。PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序，再與EZbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ezbiocloud.net)進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定菌株。

1.4.2 復(fù)合菌系構(gòu)建 參考前人的試驗(yàn)方案[15]，首先將菌株接入LB液體培養(yǎng)基，選取一株菌涂滿LB固體培養(yǎng)基，其余菌株用濾紙片浸潤(rùn)后按照?qǐng)D2的示意圖貼于固體培養(yǎng)基表面。選擇生長(zhǎng)互不影響的菌株構(gòu)建成復(fù)合菌系。

圖2 拮抗試驗(yàn)示意圖

1.4.3 發(fā)酵試驗(yàn) 本試驗(yàn)總發(fā)酵體系為200 g，總發(fā)酵固體物含量(TS)為20%，接種物含量為30%，用沼液補(bǔ)足質(zhì)量。復(fù)合菌系中的菌株按照1:1的比例，總發(fā)酵體系1%的比例接入發(fā)酵體系。本次試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)不加復(fù)合菌系的對(duì)照組和不添加發(fā)酵原料的空白組。具體物料添加表見(jiàn)表2。發(fā)酵溫度在沼氣發(fā)酵能正常產(chǎn)氣的前提下，按照復(fù)合菌系正常的生長(zhǎng)溫度設(shè)定，故本次發(fā)酵溫度設(shè)定為37±1℃。測(cè)定發(fā)酵啟動(dòng)前和發(fā)酵結(jié)束測(cè)定發(fā)酵體系的TS、揮發(fā)性固體(VS)和pH，過(guò)程中測(cè)定每日沼氣產(chǎn)量，甲烷比例。由于發(fā)酵總固體物含量較高，每日兩次搖勻發(fā)酵瓶。由于空白組產(chǎn)氣極少，實(shí)際計(jì)算中未考慮其產(chǎn)氣量。

表2 發(fā)酵物料配制

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

物料的TS和VS的測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]；pH的測(cè)定使用pHS-3C酸度計(jì)測(cè)量；產(chǎn)氣量根據(jù)儲(chǔ)氣罐上的之前標(biāo)定的刻度確定；甲烷測(cè)定使用島津GC-14B氣相色譜測(cè)定，檢測(cè)條件為柱溫50℃，進(jìn)樣口溫度為80℃，檢測(cè)器溫度為130℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解纖維素菌株篩選

初篩純化后獲得18株降解纖維素菌株，具體菌株編號(hào)見(jiàn)圖3。根據(jù)剛果紅浸染CMC-Na培養(yǎng)基后通過(guò)透明圈的大小確定6株具有較高纖維素降解能力的菌株，然后通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，復(fù)篩的培養(yǎng)基圖如圖4所示，具體的6株菌株編號(hào)和鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌株編號(hào)及其鑒定結(jié)果

圖3 降解纖維素菌株初篩

2.2 復(fù)合菌系構(gòu)建

根據(jù)篩選到的6株菌按照?qǐng)D2的方式進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，可以看出(ZC-1,NF-4)，(NF-3,NF-4)，(ZC-3,NF-4)，(NF-3,YJ-2)，(NF-3,YJ-5)，(NF-4,YJ-2)等菌株組合之間是沒(méi)有拮抗作用的，結(jié)合圖4中透明圈大小的結(jié)果，選擇(NF-3,NF-4)組合作為復(fù)合菌系。

圖4 降解纖維素菌株復(fù)篩

表4 菌株之間拮抗結(jié)果

2.3 復(fù)合菌系的添加對(duì)產(chǎn)氣量的影響

每日測(cè)得的沼氣量取平均值作折線圖，每日的沼氣量累計(jì)作折線圖，如圖5所示?？梢钥闯霾患訌?fù)合菌系的對(duì)照組和添加復(fù)合菌系的試驗(yàn)組前期日產(chǎn)氣量曲線基本類似，發(fā)酵第一天產(chǎn)氣量達(dá)到頂峰后迅速下降。但是發(fā)酵中期對(duì)照組產(chǎn)氣量緩慢上升，在發(fā)酵第13天達(dá)到最大值，然后緩慢下降至發(fā)酵結(jié)束。而試驗(yàn)組在前期達(dá)到頂峰后產(chǎn)氣降為0 mL。試驗(yàn)組發(fā)酵中后期產(chǎn)氣量一直穩(wěn)定在100 mL左右。

圖5 日產(chǎn)沼氣量和累計(jì)沼氣產(chǎn)量折線圖

日產(chǎn)甲烷量和累計(jì)甲烷產(chǎn)量如圖6所示。試驗(yàn)組和對(duì)照組前期產(chǎn)甲烷曲線類似，發(fā)酵中期對(duì)照組出現(xiàn)產(chǎn)甲烷高峰，最高日產(chǎn)甲烷量達(dá)到72.8 mL，之后逐漸回落。而試驗(yàn)組在發(fā)酵周期前半段甲烷產(chǎn)量低于對(duì)照組，待對(duì)照組進(jìn)入發(fā)酵后期，試驗(yàn)組日產(chǎn)甲烷量才穩(wěn)步提高，在第19天日產(chǎn)甲烷量達(dá)到高峰，為70.2 mL。

圖6 日產(chǎn)甲烷量和累計(jì)甲烷產(chǎn)量折線圖

對(duì)照組和試驗(yàn)組的發(fā)酵周期分別為20天和28天，總產(chǎn)氣量分別為2.4 L和3.0 L，累計(jì)甲烷產(chǎn)量分別為543.7 mL和845.1 mL。添加復(fù)合菌系使產(chǎn)氣量提高了25%，甲烷產(chǎn)量提高了55%。

2.4 復(fù)合菌系的添加對(duì)產(chǎn)氣率的影響

產(chǎn)氣率一般能體現(xiàn)物料作為發(fā)酵產(chǎn)氣的好壞標(biāo)準(zhǔn)之一，而池容產(chǎn)氣率能體現(xiàn)發(fā)酵池綜合產(chǎn)氣效率。計(jì)算對(duì)照組和試驗(yàn)組的原料產(chǎn)氣率和平均池容產(chǎn)氣率繪制柱狀圖（圖7）的分析可知，試驗(yàn)組的原料產(chǎn)氣率分別為86.4 mL/gTS和111.4 mL/gVS均比對(duì)照組提高了21.3%，而平均池容產(chǎn)氣率略低于對(duì)照組，降低了14%。

圖7 產(chǎn)氣率和平均池容產(chǎn)氣率柱狀圖

3 討論

3.1 研究的優(yōu)缺點(diǎn)及優(yōu)化方向

纖維素是農(nóng)作物秸稈的主要成分之一，為了對(duì)其進(jìn)行資源化利用，首先就要解決其轉(zhuǎn)化成可溶性糖的效率，而其被木質(zhì)素和半纖維素包裹而難以分離是主要的難點(diǎn)之一[22-25]。木質(zhì)素和半纖維素結(jié)構(gòu)沒(méi)有纖維素結(jié)構(gòu)那樣具有單一單體以單一形式的化學(xué)鍵連接排列的規(guī)律結(jié)構(gòu)，所以使用化學(xué)法和物理法對(duì)其破壞遠(yuǎn)比生物法效率高[26-27]。趙晨等[28]詳細(xì)對(duì)比各種預(yù)處理方案，總結(jié)出NaOH預(yù)處理從效果和成本考慮均是最佳，預(yù)處理7天使得原料產(chǎn)氣率達(dá)到225 mL/gVS，產(chǎn)氣量提高450%。而本試驗(yàn)在最優(yōu)條件下的原料產(chǎn)氣率也僅有111 mL/gVS，雖然高于對(duì)照組，但低于一般以餐廚廢棄物或綠色植物等為發(fā)酵原料的產(chǎn)氣率，這也可能與原料實(shí)際特性和干發(fā)酵的特點(diǎn)所致[17-19]?；诖舜卧囼?yàn)方式為干發(fā)酵，對(duì)空間利用率一般會(huì)高于正常的濕式發(fā)酵，由于本實(shí)驗(yàn)原料為難以發(fā)酵的纖維素類原料，所以綜合來(lái)看，平均池容產(chǎn)氣率基本與一般文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似[20-21]。從結(jié)果來(lái)看不論是以什么方式進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣性能均有一定的促進(jìn)作用，如果考慮成本、對(duì)環(huán)境的影響、對(duì)下游的處理成本等因素來(lái)考慮，很多預(yù)處理方式差強(qiáng)人意。生物法相對(duì)于化學(xué)法而言的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在對(duì)環(huán)境友好，對(duì)設(shè)備要求低。對(duì)廢棄物的處理若是以犧牲環(huán)境為代價(jià)便得不償失。

生物法預(yù)處理主要是利用降解纖維素菌株產(chǎn)的纖維素酶預(yù)處理或者與化學(xué)法等其他手段耦聯(lián)預(yù)處理原料，再進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣。趙肖玲[29]詳細(xì)對(duì)比了酶法預(yù)處理、菌液預(yù)處理、不同酶不同比例和兩種方法混合預(yù)處理對(duì)秸稈發(fā)酵產(chǎn)沼氣的性能的影響，結(jié)果得到混合酶預(yù)處理效果優(yōu)于菌液預(yù)處理，而兩種方法混合預(yù)處理優(yōu)于單一方法預(yù)處理的結(jié)論。這種酶法預(yù)處理僅將纖維素降解為可溶性糖，實(shí)質(zhì)與可溶性糖類原料發(fā)酵無(wú)異。而本試驗(yàn)擬解決的主要問(wèn)題是希望通過(guò)篩選出高效降解纖維素類原料的菌株構(gòu)成復(fù)合菌系，利用篩選得到的復(fù)合菌系添加至發(fā)酵體系，希望能夠與原發(fā)酵體系中的發(fā)酵菌群達(dá)到共生體系。利用產(chǎn)纖維素素酶類添加至發(fā)酵體系，不僅對(duì)原料進(jìn)行降解，而且參與到厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣循環(huán)中，相當(dāng)于增加了發(fā)酵三階段中的第一階段途徑，使得物質(zhì)能量之間代謝循環(huán)得以增強(qiáng)。與前人對(duì)比發(fā)現(xiàn)，未來(lái)所要解決的是如何縮短發(fā)酵周期，提升產(chǎn)氣效率。其中一個(gè)方向是如何篩選到更適合發(fā)酵體系的復(fù)合菌系，復(fù)合菌系比單一菌株更能適應(yīng)環(huán)境，更能提供多種不同的組合酶[30]。另一個(gè)方向是對(duì)接種物的馴化，利用原料馴化復(fù)合菌系使之更適應(yīng)原料，從而來(lái)提高產(chǎn)沼氣性能。朱繼英等[31]和席江等[32]給出不同的觀點(diǎn)，但都提出利用原料馴化接種物對(duì)菌群結(jié)構(gòu)有影響的結(jié)論。

3.2 研究的意義

21世紀(jì)以后，眾多以高科技為核心的清潔能源如核能、太陽(yáng)能、海洋能等在科技的帶動(dòng)下如雨后春筍般發(fā)展，尤其是政府成功的結(jié)合某些貧困地區(qū)的特點(diǎn)而提出的光伏脫貧模式，這為太陽(yáng)能產(chǎn)業(yè)錦上添花[33-34]。近年來(lái)沼氣行業(yè)似乎成為“夕陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”，大中型沼氣項(xiàng)目原料來(lái)源不穩(wěn)定，中小型項(xiàng)目效益低下，沼氣下游能源轉(zhuǎn)換技術(shù)不成熟，沒(méi)有政策扶持等一系列問(wèn)題擺在從業(yè)者面前[35-36]。正如前文所提到的，厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣不僅能解決能源短缺，另一個(gè)重要的方向是解決廢棄物處理問(wèn)題，從而帶動(dòng)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的健康循環(huán)發(fā)展。如今隨著農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的機(jī)械化自動(dòng)化的普及，在原料的獲取上越來(lái)越有利，如何將這些資源有效利用，并以環(huán)境治理為特色是今后科研工作者要解決的重要難題。

4 結(jié)論

試驗(yàn)經(jīng)過(guò)初篩得到18株能夠降解纖維素的菌株，經(jīng)過(guò)剛果紅浸染復(fù)篩得到6株具有較高纖維素降解能力的菌株。根據(jù)拮抗試驗(yàn)篩選到最佳的復(fù)合菌系組合為 (Bacillus siamensis, Bacillus subtilis subsp.Stercoris)，該復(fù)合菌系能共存且二者產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)。厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣試驗(yàn)中，復(fù)合菌系的添加主要影響發(fā)酵中后期的產(chǎn)氣，能夠明顯提高沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量，對(duì)原料的產(chǎn)氣率也有一定促進(jìn)作用，但是延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，降低了平均池容產(chǎn)氣率。