基于LC-MS代謝組學(xué)的紅桿與綠桿型多花黃精化學(xué)成分比較研究

姜 武，翁國杭，陳家棟，葉傳盛，姜鑫凱，陶正明

（1浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州 325005；2浙江烏巖嶺國家級自然保護(hù)區(qū)管理中心，浙江溫州 325500；3麗水億康生物科技有限公司，浙江麗水 323800；4溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江溫州 325035）

0 引言

多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)為百合科黃精屬多年生草本植物，其干燥根莖為《中國藥典》2020年版收載品種之一，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，降脂和益腎的功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，多花黃精含有多糖、皂苷類和黃酮類等主要有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫，抗氧化、延緩衰老、抗疲勞、降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、改善造血功能等多種藥理作用[3]。研究表明，不同產(chǎn)地多花黃精中多糖、黃酮和浸出物含量存在差異，地理環(huán)境、生長年限和采收季節(jié)是影響其化學(xué)成分含量的關(guān)鍵因素[4]。倪天宇等[5]采集了浙江地區(qū)不同生境下的多花黃精，分別測定多花黃精的折干率、浸出物、黃精多糖、總黃酮、總皂苷和總酚含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同生境下多花黃精折干率、浸出物、多糖及總皂苷含有量差異顯著；折干率與化學(xué)成分含有量均呈正相關(guān)。涂明峰等[6]對8個產(chǎn)地收集的多花黃精中多糖、黃酮、多酚、浸出物、Cu、Se、Pb、Cd的含量進(jìn)行比較分析也發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的多花黃精化學(xué)成分含量存在一定的差異。多花黃精廣泛分布于長江流域及珠江流域，其中安徽、湖南、浙江等地產(chǎn)多花黃精品質(zhì)較好可視為道地產(chǎn)區(qū)。不同產(chǎn)地因其生長環(huán)境不同，化學(xué)成分也存在一定的差異性，氣候、緯度、地理位置等多種因素都會對多花黃精的化學(xué)成分含量造成影響[7]。前人關(guān)于不同產(chǎn)地多花黃精化學(xué)成分差異性的研究較多[8-12]，但采用LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)對不同產(chǎn)地多花黃精化學(xué)成分進(jìn)行比較分析尚未見文獻(xiàn)報道。中藥材的化學(xué)成分是其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，揭示不同種質(zhì)多花黃精的化學(xué)成分差異是其質(zhì)量評價的基礎(chǔ)。植物代謝組學(xué)可對植物提取物中代謝組進(jìn)行無差別代謝成分全分析，對具體藥用部位及具體化學(xué)成分尚不清楚的中藥材尤其適用，該技術(shù)已成功應(yīng)用于半楓荷根[13]、野菊花[14]、林下山參生長年限鑒定[15]等研究。該技術(shù)不僅可以反映不同樣品之間的相似性，還可確定不同樣本的差異性，為中藥質(zhì)量控制提供了一種有別于指紋圖譜的整體性分析方法。

本課題組在浙江麗水慶元百山祖（紅桿）和溫州永嘉四海山（綠桿）中發(fā)現(xiàn)了兩種野生品種，通過多年的引種栽培發(fā)現(xiàn)在性狀及抗逆性方面紅桿型多花黃精均優(yōu)于綠桿型，為豐富浙江產(chǎn)多花黃精種質(zhì)資源庫及選育品質(zhì)更加優(yōu)良的多花黃精品種，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)的植物代謝組學(xué)方法對麗水慶元百山祖（紅桿）和溫州永嘉四海山（綠桿）多花黃精藥材的整體化學(xué)輪廓進(jìn)行比較分析，通過主成分分析法進(jìn)行比較研究，旨在研究不同種質(zhì)浙產(chǎn)多花黃精化學(xué)成分差異，為后期的紅桿型多花黃精品質(zhì)評價及栽培育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器系統(tǒng)主要包括高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜Thermo LC-MS(Ulimate 3000LC,Q Exactive)，色譜柱：Hyper gold C18(100×2.1×1.9 mm)；離心機(jī)(Heraeus Fresco 17,Thermo Fisher Scientific)；天平(BSA124SCW，Sartorius)；研磨儀（JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）；純水儀（明澈D24UV，Merck Millipore）；超聲儀（PS-60AL，深圳市雷德邦電子有限公司）。

甲醇（LC-MS級67-56-1），購自Merck(Darmstadt,Germany)；乙腈（LC-MS級 75-05-8），購自 Merck(Darmstadt,Germany)；甲酸（LC-MS級64-18-6），購自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)；超純水（LC-MS級7732-18-5），購自 Merck(Darmstadt,Germany)；L-2-氯苯丙氨酸（純度≥98%），購自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)。

1.2 試驗材料

紅桿和綠桿多花黃精分別于2019年10月底采自浙江麗水市慶元縣百山祖鄉(xiāng)(118°50'E,27°47'N)、溫州永嘉四海山(120°43'E,28°29'N)，其生長年限為第3年。樣品經(jīng)浙江省亞熱帶作物研究所陶正明研究員鑒定為多花黃精。

1.3 農(nóng)藝性狀檢測

于2019年10月初，每個種質(zhì)隨機(jī)選取生長良好、長勢基本一致的100株不同種多花黃精定點定株標(biāo)記。分別以直尺和游標(biāo)卡尺測定株高、莖粗；以LI-3000C葉面積儀測定葉長、葉寬和葉面積；采集10片葉片采用疊加測定法測定葉厚；并采用潘德芳[16]的方法測定根莖多糖含量。在兩個種質(zhì)樣地采集3個區(qū)域，每個區(qū)域至少10株重復(fù)，其中紅桿和綠桿多花黃精分別做3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 色譜條件

柱溫為40℃；流速300 μL/min；流動相組成A：水＋0.1%甲酸，B：乙腈＋0.1%甲酸；進(jìn)樣量為4 μL，自動進(jìn)樣器溫度4℃，其中液相色譜流動相反應(yīng)條件見表1。

表1 液相色譜流動相條件

1.5 質(zhì)譜條件

正模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 KV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，30%。負(fù)模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，60%。掃描模式：一級全掃描(Full Scan,m/z 70～1050)與數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描(dd-MS2,TopN=10)；分辨率：70000（一級質(zhì)譜），17500（二級質(zhì)譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離(HCD)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Compound discoverer軟件（Thermo公司）對LC-MS檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和預(yù)處理，整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包含保留時間(RT)、分子量(MW)、觀察量（樣本名稱）、峰強(qiáng)度等信息。對QC樣品的總離子流色譜圖(TIC)色譜圖進(jìn)行重疊。多元分析采用SIMCAP 13.0軟件，對不同類型多花黃精差異化學(xué)成分進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法辨別分析(OPLS-DA)，采用Sigmaplot 10軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅桿與綠桿多花黃精農(nóng)藝性狀及多糖成分含量比較分析

由表2可知，除株高、莖粗外，紅桿多花黃精葉厚、葉長、葉寬、葉面積等農(nóng)藝性狀均顯著優(yōu)于綠桿型多花黃精，說明多花黃精不同種源之間差異較大。麗水產(chǎn)紅桿多花黃精不僅葉厚、葉長、葉寬、葉面積農(nóng)藝性狀優(yōu)勢明顯，且田間觀察發(fā)現(xiàn)整齊性較高，生長比較穩(wěn)定。

表2 不同多花黃精農(nóng)藝性狀差異比較分析

黃精多糖是多花黃精最重要的藥用成分，據(jù)中國藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，合格黃精藥材多糖含量不低于7%。由表3可以看出，兩地產(chǎn)多花黃精多糖含量均達(dá)到藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，其中紅桿型黃精多糖含量高達(dá)11%以上，說明兩產(chǎn)地多花黃精多糖含量差異較大。

表3 不同多花黃精種質(zhì)多糖含量比較分析

2.2 紅桿與綠桿多花黃精化學(xué)成分輪廓分析

采用LC-MS對紅桿型與綠桿型多花黃精花樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同類型多花黃精中的化學(xué)成分種類基本相同，含量卻有所差異。圖1為多花黃精根莖總離子流圖，由于多花黃精在正離子模式(ESI+)下離子化效果較好，QC樣品總離子流色譜圖穩(wěn)定，導(dǎo)出的化合物靈敏度較高且樣品重現(xiàn)性較好，因此本研究采用正離子模式進(jìn)行檢測分析。結(jié)合文獻(xiàn)[17-18]，依據(jù)LCMS矩陣中的得保留時間注釋來源、預(yù)測成分以及NIST11檢索匹配進(jìn)行指認(rèn)，共鑒定出22種主要化合物，結(jié)果見表4。

表4 多花黃精根莖化學(xué)成分LC-MS分析

圖1 QC樣本總離子流色譜圖(ESI+)

2.3 多花黃精樣品主成分分析

將采集的不同地點多花黃精藥材數(shù)據(jù)樣本導(dǎo)入SIMCA-P 11.0軟件，以樣本的峰面積相對百分含量為特征值，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PCA分析。PCA為無監(jiān)督的分析方法，可以反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，同時反映組內(nèi)和組間的差異；為了突出組間差異，便于后續(xù)尋找差異成分，采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)（圖2）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。麗水慶元百山祖（紅桿）和溫州永嘉四海山（綠桿）多花黃精樣本在主成分空間中的分布比較分散，浙江麗水與溫州由于地理位置和氣候條件的差異，不同地理特征種植區(qū)域樣本處于主成分空間分布位置也不同，多花黃精化學(xué)成分組成及比例也具有一定的特征性，結(jié)果見圖2。

圖2 紅桿與綠桿型多花化學(xué)輪廓的OPLS-D(左)和S-plot(右)得分(R2X=0.665,R2Y=0.997,Q2=0.982)

將2個產(chǎn)地的多花黃精藥材樣本數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PCA分析，所得到的載荷圖如圖3所示。從載荷圖上可以看出69個組分峰分布比較分散，得分圖中的G組與R組樣品點之間的分布有所散離，說明兩組樣品之間的代謝產(chǎn)物存在一定的差異，但沒有實現(xiàn)完全的分離，組內(nèi)樣品之間的樣本點分布較為分散，R2和Q2是數(shù)據(jù)模型質(zhì)量參數(shù)，R2＞0.5說明模型擬合效果好，且PCA得分圖中所有樣品均在95%置信區(qū)間。使用正離子模式數(shù)據(jù)生成的PCA模型的質(zhì)量(R2=0.665,Q2=0.982)要優(yōu)于負(fù)離子模式(R2=0.537,Q2=0.886)，樣品的聚類分離效果也較好，該結(jié)果表明不同產(chǎn)地的多花黃精化學(xué)成分在組分和含量上差異較大，PCA載荷圖分析結(jié)果與LC-MS分析結(jié)果相一致。

圖3 不同產(chǎn)地多花黃精樣品主成分分析載荷圖

為防止發(fā)生過度擬合常用置換檢驗?zāi)Ｐ偷挠行?，若Q2值大于左邊任意一個Y變量隨機(jī)排列模型的Q2值，在Y軸上的截距小于0可認(rèn)為該模型質(zhì)量較好，沒有發(fā)生過度擬合[19]。重復(fù)測試200次循環(huán)迭代置換檢驗結(jié)果圖見圖2，Q2的回歸直線與Y軸的交點在負(fù)半軸，正離子模式Q2Y(cum)(0,0.988)，Q2(cum)(0,-0.0853)，說明建立的OPLS-DA模型是穩(wěn)定可靠的，不存在擬合現(xiàn)象。因此，可用來探究紅桿型和綠桿型多花黃精的化學(xué)成分及代謝物差異。

2.4 紅桿與綠桿多花黃精差異代謝物分析

以O(shè)PLS-DA模型的VIP得分(VIP＞1)，并結(jié)合t檢驗(t-test)的結(jié)果P值(P＜0.05)來尋找兩品種間的標(biāo)志性差異代謝物。由表4可知，兩種多花黃精樣品中共篩選出22種代謝產(chǎn)物，其中篩選得到15種差異代謝物在紅桿多花黃精中的相對含量高于綠桿多花黃精，說明兩種多花黃精由于栽培地點及生態(tài)環(huán)境的差異，相同代謝產(chǎn)物的含量也有所差別，結(jié)果見表5。差異代謝物中，發(fā)現(xiàn)多種參與蛋白合成的氨基酸，如脯氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、谷氨酸存在顯著差異，氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，還具有滋補(bǔ)強(qiáng)身功效。另外，紅桿品系多花黃精的檸檬酸顯著高于綠桿，檸檬酸為一種抗氧化劑，有抑制細(xì)菌等作用。檸檬酸還具有螯合作用，能夠清除某些有害金屬。說明紅桿多花黃精可能具有更強(qiáng)的抗逆性。

表5 紅桿與綠桿多花黃精LC-MS分析差異代謝物的VIP值

3 討論

3.1 紅桿與綠桿型多花黃精農(nóng)藝性狀差異研究

本研究中，多花黃精的株高、葉面積等農(nóng)藝性狀及藥用有效成分根莖多糖在不同種源間均達(dá)到顯著或極顯著差異，說明多花黃精不同種源間蘊(yùn)藏著豐富的遺傳變異，存在著較大的優(yōu)良種源選擇潛力[20]。研究表明多花黃精的葉面積與株高均呈極顯著正相關(guān)，與根莖鮮質(zhì)量呈顯著正相關(guān)，這說明可以利用葉面積對高產(chǎn)多花黃精進(jìn)行優(yōu)良種源做初步選擇；多花黃精根莖多糖含量與株高、莖粗均呈負(fù)相關(guān)，這意味著多花黃精生長的越快，其有效成分含量積累的越少[21-24]。筆者經(jīng)過多年研究，成功的進(jìn)行紅桿多花黃精的引種，通過兩地的種源比較分析，進(jìn)一步表明紅桿多花黃精品質(zhì)優(yōu)良。

3.2 紅桿與綠桿型多花黃精差異化合物篩選分析

多花黃精野生資源主要分布在安徽、貴州、浙江、湖南、云南等地，近年來多花黃精人工栽培面積在浙江省逐年增加，而浙江不同產(chǎn)地多花黃精品質(zhì)差異相關(guān)研究尚未見文獻(xiàn)報道[25-26]。本研究通過表型鑒定發(fā)現(xiàn)浙江麗水慶元百山祖生長多花黃精多為紅桿，而溫州永嘉四海山所產(chǎn)則為綠桿，為了探究兩地產(chǎn)多花黃精內(nèi)在品質(zhì)的差異，本研究利用LC-MS代謝組技術(shù)對兩地采集的樣本進(jìn)行化學(xué)成分差異性分析。通過PCA主成分分析發(fā)現(xiàn)，兩地產(chǎn)多花黃精藥材中的化學(xué)物質(zhì)成分種類和相對含量差異較大。紅桿與綠桿型多花黃精的代謝輪差異明顯，表明兩者在化學(xué)成分上存在明顯差異。12個多花黃精樣本中共鑒定出22個化合物，兩種質(zhì)多花黃精化學(xué)成分的組分和代謝產(chǎn)物VIP值差異顯著。分析結(jié)果表明，檸檬酸、苯甲酸、甲氧基水楊酸、L-色氨酸、5-羥甲基糠醛、脯氨酸、丙酮酸、L-賴氨酸、組氨酸和γ-亞麻酸乙酯等10類差異代謝物含量在兩者間存在顯著差異。這些結(jié)果表明紅桿和綠桿型不僅在形態(tài)方面存在差異，其內(nèi)在化學(xué)成分也不盡相同，紅桿品系相比較綠桿有更佳的營養(yǎng)品質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報道已知11月降水量、月降水量等環(huán)境因子是影響多花黃精分布的主導(dǎo)環(huán)境因子，而季節(jié)降水量變異系數(shù)和最暖季平均溫對多花黃精的分布影響最小，這說明決定多花黃精能否在當(dāng)?shù)厣L的主要因素是春秋二季月降水量，夏季的氣候條件對多花黃精的影響較小[27-28]。盡管多花黃精的適宜栽培地區(qū)較為廣泛，但是不同產(chǎn)地的降水量、氣候以及土壤差異都會影響其內(nèi)在品質(zhì)。陳龍勝等對不同產(chǎn)地多花黃精揮發(fā)性物質(zhì)研究表明湖北赤壁、湖北隨州、湖北恩施和湖南岳陽所產(chǎn)多花黃精揮發(fā)性成分較為一致，但安徽所產(chǎn)多花黃精和湖北地區(qū)相比，所含化學(xué)成分存在較大差異，其中栽培基質(zhì)對多花黃精生長及有效成分積累也有較大影響[29-30]。

4 結(jié)論

本研究采集了浙江2個產(chǎn)地不同區(qū)域的2種不同表型多花黃精種質(zhì)，通過農(nóng)藝性狀比較研究顯示麗水產(chǎn)紅桿種質(zhì)的葉厚、葉長、葉寬、葉面積和多糖含量等指標(biāo)均顯著優(yōu)于永嘉產(chǎn)綠桿多花黃精，說明不同產(chǎn)區(qū)多花黃精不同種間差異較大。代謝組結(jié)果顯示多花黃精樣本共鑒定出22個化合物，2種質(zhì)多花黃精根莖的檸檬酸、L-色氨酸、脯氨酸、L-賴氨酸、組氨酸等10差異代謝物含量存在顯著差異，且以紅桿種質(zhì)含量較高。隨著黃精人工栽培面積的快速增長，人們對黃精藥材的要求已經(jīng)不僅僅局限于“量”，從滿足“健康中國”和“人民日益增長的美好生活需要”角度來看，黃精藥材的品質(zhì)更應(yīng)得到關(guān)注。本研究結(jié)果對浙江產(chǎn)多花黃精的生態(tài)適應(yīng)性評價和新品種選育具有重大意義。