一株纖維素降解菌的篩選與鑒定

楊 娜，何 鑫，杜春梅

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3河北環(huán)境工程學(xué)院/河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066102）

0 引言

玉米秸稈是一種可再生能源，全國(guó)玉米秸稈年產(chǎn)量約2.64億t[1]，其中被有效加工利用的秸稈僅有不到20%。在全球范圍內(nèi)，玉米秸稈主要通過燃燒的方式處理，造成了極大的浪費(fèi)而且污染環(huán)境。雖然可以用物理和化學(xué)方法來(lái)有效水解復(fù)雜的纖維素聚合物，但物理化學(xué)處理通常需要苛刻和極端的條件[2-3]。利用微生物降解秸稈具有效率高、對(duì)環(huán)境無(wú)害且反應(yīng)溫和的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為秸稈降解研究的熱點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。分離和篩選高效纖維素降解菌能為制備高效微生物腐熟劑奠定基礎(chǔ)，利用微生物腐熟劑處理玉米秸稈，對(duì)推進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。

纖維素是一種含有β-1,4-糖苷鍵的線性大分子多糖[4-5]，是秸稈細(xì)胞壁組成的主要成分，玉米秸稈的纖維素含量高達(dá)38%～50%[6]。此外，秸稈中的木質(zhì)素和半纖維素的存在使得秸稈降解率較低。纖維素可以被纖維素酶完全水解為葡萄糖，首先內(nèi)切葡聚糖酶沿纖維素鏈隨機(jī)水解β-1,4-糖苷鍵，之后外切葡聚糖酶作用于纖維素鏈的還原端或非還原端，對(duì)β-1,4-糖苷鍵進(jìn)行水解產(chǎn)生纖維二糖，最終β-葡聚糖苷酶將纖維二糖和水溶性纖維糊精水解成葡萄糖[7-8]，這3種酶是由細(xì)菌、放線菌和真菌等微生物自然產(chǎn)生的[9-10]。微生物可以產(chǎn)生大量的纖維素酶降解秸稈中的纖維素，解決秸稈腐熟速度慢的問題。目前，纖維素降解菌及其產(chǎn)生的酶因其具有經(jīng)濟(jì)潛力大、對(duì)生態(tài)環(huán)境友好而備受關(guān)注。前人研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生纖維素酶的微生物主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌，真菌主要分布在木霉屬、青霉屬、曲霉屬和毛殼菌屬[11-12]，細(xì)菌主要分布在芽孢桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬[13-15]，放線菌主要分布在鏈霉菌屬[16-17]。然而，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了較多的微生物可用于秸稈腐熟，但是能在生產(chǎn)中應(yīng)用的并不多，其中很多菌株是從牛糞中分離得到，在糞肥存在的情況下，才能發(fā)揮其效力。目前國(guó)內(nèi)氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的尾液，這些尾液富含大量的蛋白和氨氮類物質(zhì)，處理難度較大，成本較高[18]，如果能將這些尾液應(yīng)用于有機(jī)肥生產(chǎn)，不但解決了氨氮和秸稈對(duì)環(huán)境的污染問題，還能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，有助于推進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。本研究以氨基酸尾液為氮源，對(duì)自然堆腐條件不同時(shí)期的玉米秸稈進(jìn)行取樣，篩選高效降解纖維素的菌株并進(jìn)行鑒定，獲得了能夠快速降解玉米秸稈的菌株，為制備高效玉米秸稈腐熟劑，利用氨基酸尾液和玉米秸稈制備有機(jī)肥料奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 樣品采集于自然堆腐發(fā)酵各階段，4℃冷藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、玉米秸稈段液體發(fā)酵培養(yǎng)基、固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，均參照文獻(xiàn)配制[19-22]。

1.2 菌株的分離純化

取10 g不同時(shí)期堆腐中的秸稈，加入到裝有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，180 r/min搖床培養(yǎng)30 min，靜止20 min，取1 mL進(jìn)行梯度稀釋，得到濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌液，涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基及PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做3個(gè)平板，30℃倒置培養(yǎng)，直至菌落長(zhǎng)出，挑選不同菌株分離純化，獲得純種菌株。

1.3 菌株的初篩

采用點(diǎn)接種法分別將菌株接種至羧甲基纖維素鈉平板上，每個(gè)平板接3個(gè)點(diǎn)，30℃培養(yǎng)3天后，用1 mg/mL的剛果紅染液染色30 min，棄去染液，加入1 mol/L的NaCl溶液脫色20 min。降解纖維素的能力以水解圈與菌落直徑比值大小為指標(biāo)，記錄水解圈和菌落直徑。

1.4 菌株的復(fù)篩

1.4.1 纖維素相關(guān)酶活性測(cè)定 粗酶液的制備：按體積比為15%的接種量將培養(yǎng)物接種于固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)4天，10 g固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基加100 mL水，37℃，100 r/min氣浴振蕩提取1 h，發(fā)酵液經(jīng)無(wú)菌紗布過濾后在8000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

酶活力測(cè)定：濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活力、外切葡聚糖酶活力、β-葡聚糖苷酶活力，參照許玉林等[23]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 玉米秸稈降解率測(cè)定 將菌株接種至種子培養(yǎng)基，之后按5%的比例接種至玉米秸稈段液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以接種等量無(wú)菌水為空白對(duì)照，在30℃、180 r/min條件下液體發(fā)酵10天。液體發(fā)酵降解結(jié)束后，5000 r/min離心10 min，棄上清，得到的玉米秸稈降解剩余物用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)清洗3次，80℃烘干至恒重，稱重，計(jì)算降解率，公式見(1)。

式中，m1為發(fā)酵前烘干至恒重的秸稈重量，g；m2為發(fā)酵后烘干至恒重的殘余秸稈的重量，g。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將待鑒定的菌株接種在PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5天，觀察菌落形態(tài)和顏色，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子、產(chǎn)孢體、菌絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)。參考《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行分類鑒定。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定 使用真菌基因DNA提取試劑盒（索萊寶）進(jìn)行DNA提取后，利用曲霉的特異引物[β-tubulin(Ben A)Bt2a 5'-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3'、Bt2b 5'-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3']擴(kuò)增，產(chǎn)物由擎科生物測(cè)序，將ITS區(qū)片段的測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并采用Mega軟件分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與初篩

將從玉米秸稈樣品中分離純化得到的菌株，通過羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基經(jīng)剛果紅染色后得到6株具有纖維素降解能力的菌株。其中ND19透明圈最大，D/d值為 2.83（表 1）。

表1 剛果紅染色試驗(yàn)結(jié)果

2.2 纖維素降解菌的復(fù)篩

2.2.1 纖維素酶活力測(cè)定 由圖1可知，不同菌株的同一種酶活力大小不同，相同菌株的4種酶活差別也很大。6株菌中濾紙酶活最大的為SC2，酶活為17.7 U/mL，SC4的內(nèi)切葡聚糖酶活力最大，為58.97 U/mL，SC4的外切葡聚糖酶活力最大，為16.85 U/mL，但與SC2的差異不顯著，β-葡聚糖苷酶活最高的為SC2，顯著高于其他5株菌，達(dá)到79.26 U/mL。

圖1 不同菌株4種纖維素酶的活力

2.2.2 玉米秸稈降解率測(cè)定 如圖2所示，6株菌均對(duì)玉米秸稈均有一定的降解作用，其中SC2對(duì)玉米秸稈的降解效果最好，降解率達(dá)到33.07%，SC4的降解效果次之，玉米秸稈的降解率為32.85%。

圖2 不同菌株對(duì)玉米秸稈的降解率

2.3 菌株SC2的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 在PDA培養(yǎng)基上，SC2最初為白色，之后變成黑褐色厚絨狀，產(chǎn)生大量黑褐色孢子（圖3A），背面中央略帶黃褐色（圖3B），顯微鏡下觀察，分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，頂端分生孢子頭呈球形頂囊，上面有大量褐色球形分生孢子，直徑3.2 μm-3.9 μm（圖3C）。

圖3 菌株SC2顯微形態(tài)及菌落形態(tài)

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）顯示，菌株SC2與黑曲霉(Aspergillus niger HQ632726.1)的親緣關(guān)系最近，結(jié)合其形態(tài)特征，將SC2鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger)。

圖4 菌株SC2的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 纖維素降解菌的分離篩選

中國(guó)玉米秸稈產(chǎn)量大，如果能夠進(jìn)行有效的利用，不僅能提高生物質(zhì)資源的利用，還可以有效降低環(huán)境污染。但是秸稈纖維素有很強(qiáng)的糖苷鍵，降解困難，因此大部分纖維素不能被有效利用[24]。目前，大部分玉米等農(nóng)作物秸稈的處理方式仍然是被焚燒，不但造成資源的浪費(fèi)，而且污染環(huán)境[25]。為了合理有效的利用玉米秸稈纖維素，篩選高效降解纖維素的微生物引起了廣泛的關(guān)注。纖維素降解菌通常是從腐殖土壤、腐爛秸稈、牛糞等進(jìn)行分離。黃亞麗等[26]從土壤中篩選出一株低溫秸稈降解菌長(zhǎng)枝木霉，使用沙袋法測(cè)定15天、30天、45天的玉米秸稈降解率，結(jié)果表明45天時(shí)玉米秸稈降解率達(dá)到56.73%。劉曉飛等[17]從寒地黑土中分離到一株鏈霉菌，濾紙酶活為11.94 U/mL，培養(yǎng)5天時(shí)，對(duì)玉米秸稈降解率達(dá)到23.54%，其中纖維素降解率為30.33%。Sun等[27]對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行了產(chǎn)羧甲基纖維素酶和濾紙酶條件優(yōu)化，優(yōu)化后對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別為35.42%、17.47%和20.19%。張冬雪等[28]在稻田土壤中分離篩選出一株草酸青霉菌，其CMC酶活在第5天時(shí)達(dá)到最高，為29.35 U/mL，培養(yǎng)15天后對(duì)水稻秸稈的降解率達(dá)到45.72%。王勇等[29]從堆積枯枝的腐殖土壤中篩選到一株黑曲霉，其濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活分別為17.35、8.47、16.35 U/mL。孫美娜等[30]從棉稈表面分離到4株真菌，分別為黑曲霉、赤霉、鏈格孢霉、青霉菌，10天時(shí)黑曲霉對(duì)于棉花秸稈的降解率為30.06%。但是，迄今為止未見有從以氨基酸尾液為氮源的自然發(fā)酵堆肥中分離秸稈降解菌的報(bào)道。本研究從以氨基酸尾液為氮源的自然發(fā)酵堆肥中分離到1株黑曲霉SC2，其濾紙酶活為17.70 U/mL，玉米秸稈降解率為33.07%。本研究為提高玉米秸稈的降解率，開發(fā)微生物堆肥菌劑或酶制劑奠定了工作基礎(chǔ)。

3.2 利用氨基酸尾液降解秸稈

氨基酸尾液的產(chǎn)量很大，每生產(chǎn)1 t純氨基酸會(huì)產(chǎn)生40 t的發(fā)酵尾液，培養(yǎng)單細(xì)胞酵母蛋白是處理氨基酸尾液最常用的方法，還可以制成復(fù)合肥、蛋白飼料等，但成本高、效果也不理想。李思楊[31]以氨基酸尾液為氮源，利用復(fù)合菌劑處理水稻秸稈，降解率達(dá)到16.08%。這表明可以將氨基酸尾液作為氮源對(duì)秸稈進(jìn)行腐熟，一方面能有效解決氨基酸尾液的治理問題，另一方面氨基酸尾液用于堆肥比尿素成本更低，可以產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益。本研究從以氨基酸尾液為氮源的自然發(fā)酵堆肥中分離到1株降解率較高的菌株，為制備更高效的復(fù)合菌劑奠定了基礎(chǔ)。

3.3 復(fù)合菌劑降解秸稈的發(fā)展趨勢(shì)

在自然界中，纖維素的降解過程一般是多種微生物產(chǎn)生的多種酶之間協(xié)同作用的結(jié)果。而野生型單一菌株很難產(chǎn)生纖維素降解所需要的全部酶，且單一菌株產(chǎn)生的不同酶的活性存在顯著差異，導(dǎo)致其降解作用和效果有限。因此，野生型菌株SC2的降解率還有很大的提升空間，可以通過對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化、高效菌株的選育、以及與其他菌株復(fù)配等手段，大大提高其作用效率。Gong等[32]從腐殖質(zhì)中篩選出3株分別對(duì)木質(zhì)素、纖維素、半纖維素高效降解的菌株，并構(gòu)建了高效降解玉米秸稈的復(fù)合菌系，在最佳工藝條件下，該復(fù)合菌系降解后的玉米秸稈失重率達(dá)60.55%。李靜等[33]通過分離篩選菌株后將類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬進(jìn)行復(fù)配，對(duì)玉米秸稈的降解率為31.8%，比構(gòu)成復(fù)合菌系中的單菌株有顯著提高。后續(xù)，本實(shí)驗(yàn)室將利用SC2與其他產(chǎn)纖維素酶菌株組合構(gòu)建高效的纖維素降解菌系，以期能為高效腐熟玉米秸稈菌劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，為促進(jìn)玉米秸稈堆肥發(fā)酵的腐熟過程，提高玉米秸稈資源的利用提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從以氨基酸尾液為氮源的自然發(fā)酵堆肥中分離篩選得到1株高效纖維素降解菌SC2，其濾紙酶活為17.70 U/mL，玉米秸稈降解率為33.07%，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger)。