Mechlppdk基因在木薯中的表達(dá)分析及RNA干擾載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

王海燕，陳 新，周新成，沈 旭，孔 華，王文泉

（1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，南京 210095；3海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，?？?570228）

0 引言

木薯是具有高生物量的重要熱帶植物，起源于南美洲，是全球三大塊根作物之一，第六大糧食作物和新興能源作物，具有高效累積光合產(chǎn)物和抗旱、耐瘠薄等特性[1]，廣泛種植于全球熱帶地區(qū)和中國(guó)兩廣，海南地區(qū)。栽培木薯是典型的C3-C4型熱帶植物，具有高光效高淀粉累積的特點(diǎn)。木薯塊根中積累貯藏的同化物僅僅是地上合成同化物的1/5，所以木薯葉片具有超強(qiáng)的光合碳固定能力。但是C4型碳固定對(duì)木薯葉片的這種超強(qiáng)光合碳固定的作用效率尚未見(jiàn)報(bào)道。

栽培木薯葉片PEPC酶的活性從8.3～80 mmol/(kg(Chl)·s)，約是玉米和高粱的 15%～25%[2]。栽培木薯PEPCase活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于田間大豆等C3植物的活性，與C3-C4中間型黃花菊屬幾個(gè)種的活性相當(dāng)，比包含類(lèi)似花環(huán)結(jié)構(gòu)、C3-C4型黍?qū)俚腜anicum milioides中的活性高2～3倍[3]，C4PEPC的存在通過(guò)免疫學(xué)方法得到進(jìn)一步確證。利用來(lái)自玉米的PEPC、蘋(píng)果酸酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的探針均能在栽培木薯葉片中檢測(cè)到蘋(píng)果酸酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的存在。當(dāng)前對(duì)栽培木薯光合作用屬于C3-C4中間型的認(rèn)識(shí)僅限于栽培木薯葉片中有C4酶的存在，但是其中C4光合碳同化的效率，及對(duì)木薯生長(zhǎng)發(fā)育的影響迄今尚未有報(bào)道。

丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)是C4光合作用的關(guān)鍵酶，催化C4光合作用原初CO2固定的受體磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的再生，繼而由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化PEP接受二氧化碳，合成草酰乙酸(OAA)，至此完成二氧化碳的固定。玉米中C4循環(huán)是由葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞協(xié)作完成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)玉米PPDK是C4循環(huán)的限速酶，一旦PPDK的活性被干擾，C4途徑就會(huì)被影響[4]。PPDK首先是在C4植物中發(fā)現(xiàn)[5]，后面相繼在C3植物，原生動(dòng)物和細(xì)菌都有發(fā)現(xiàn)。PPDK在C3和C4植物中是以同型四聚體形式存在，在細(xì)菌和原生動(dòng)物是以二聚體形式存在[6]，但他們的初級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，表明ppdk基因在原核生物和真核生物分化前就存在了。迄今，科學(xué)家們已在多種植物中克隆到 ppdk基因，如小麥[7]、玉米[8]、水稻[9]、擬南芥[10]、甘蔗[11]、高粱[12]、籽粒莧[13]、家稗[14]等。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可致該mRNA發(fā)生特異性降解從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象[15]。該技術(shù)能夠干擾特定基因，高效、特異地阻斷體內(nèi)基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，具有高效性、擴(kuò)大性、特異性及可遺傳性等特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)多年實(shí)踐，RNA干擾技術(shù)日趨成熟，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物基因功能研究[16-17]。本研究擬利用QPCR確定Mechlppdk在木薯不同組織器官的表達(dá)譜，構(gòu)建木薯Mechlppdk的RNA干擾載體，并轉(zhuǎn)化木薯，獲得Mechlppdk的干擾突變體，為下一步木薯丙酮酸磷酸雙激酶基因Mechlppdk功能的研究提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

ppdk基因表達(dá)譜分析木薯材料葉片，莖稈，塊根均采自生物所試驗(yàn)地田間種植180天木薯植株(Mahnihot esculenta var.Arg7)。木薯遺傳轉(zhuǎn)化用材料是模式木薯TMS60444。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α系本實(shí)驗(yàn)室留存，農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404是上海生命科學(xué)研究院張鵬研究員饋贈(zèng)，RNA干擾中間載體pHANNIBAL和pART27表達(dá)載體是本研究所郭安平課題組饋贈(zèng)；Taq DNA polymerase、pMD18-T、T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，其他生化試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。引物合成和DNA測(cè)序是由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 木薯葉片RNA提取和cDNA的合成 參照李正緒方法進(jìn)行[18]。

1.2.2 Mechlppdk QPCR引物設(shè)計(jì) 通過(guò)比對(duì)GeneBank上公布的木薯Mechlppdk的cDNA序列，在轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)設(shè)計(jì)定量引物，如下QF：5’-GCAGGGGTATAGAGGAT CGC-3’；QR:5’-GGCGCCGTCCTAATTAACAT-3’，木薯的β-actin基因作為管家基因，actinF：5’-CAAGGGCAACATATGCAAGC-3’，actinR：5’-CCTT CGTCTGGACCTTGCTG-3’。熱循環(huán)儀是Rotor-gene 6000，擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性 1 min；95℃ 10 s，59℃ 15 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取其平均值用于表達(dá)分析。采用2-ΔΔCT進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 Mechlppdk RNAi的引物設(shè)計(jì) 通過(guò)找到Mechlppdk的特異區(qū)段，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，即在引物序列前分別加兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，形成帶有不同酶切位點(diǎn)的兩個(gè)反向互補(bǔ)片段，具體引物序列如下：senseF:5’-GAATTCATGTCGTCGGCG-3’；senseR：5’-AGGAGCAAGAGACTCGAG-3’；antisenseF：5’-ATC GATTCTCTTGCTCCT-3’；antisenseR：5’-CGCCG ACGACATTCTAGA-3’。同時(shí)把中間載體的內(nèi)含子序列加到反向互補(bǔ)片段之間，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 木薯Mechlppdk RNAi片段的PCR擴(kuò)增及RNA干擾中間載體的構(gòu)建 以1.2.2中合成的cDNA為模板，利用上述設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增Mechlppdk的特異片段，電泳，切膠、回收后連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α)后，提取質(zhì)粒并測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果選取與所設(shè)計(jì)干擾片段序列一致的兩個(gè)質(zhì)粒分別命名為p Mechlppdki-XE和p Mechlppdki-CX，分別用Xho I/EcoR I和Cla I/Xba I進(jìn)行雙酶切，電泳，切膠回收目的片段分別命名為Mechlppdki-XE和Mechlppdki-CX。同時(shí)用Xho I/EcoR I雙酶切中間載體p HANNIBAL，膠回收大片段后用T4DNA連接酶將其與回收的Mechlppdki-EX連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α)后用氨芐（終濃度為50 μg/L）篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切檢測(cè)Mechlppdki-XE是否與pHANNIBAL載體連接，連接上Mechlppdki-XE的pHANNIBAL質(zhì)粒命名為pHANNIBAL-MechlppdkiXE，將pHANNIBALMechlppdkiXE進(jìn)行Cla I/Xba I的雙酶切，切膠，回收目的片段后用T4DNA連接酶將其與回收的Mechlppdki-CX連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α)后用氨芐（終濃度為50 μg/L）篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，獲得陽(yáng)性克隆，命名為pHANNIBAL-MechlppdkiXECX。

1.2.5 RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室干擾載體pART27的質(zhì)粒圖譜，使用Not I對(duì)pHANNIBALMechlppdkiXE-CX和pART27分別進(jìn)行Not I酶切，電泳，切膠回收，將回收后的MechlppdkiXE-CX大片段和pART27的大片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α)后用卡那霉素（終濃度為50 μg/L）篩選陽(yáng)性克隆Mechlppdk RNAi表達(dá)載體，具體流程詳見(jiàn)圖1。

圖1 Mechlppdk RNAi干擾載體構(gòu)建流程圖

1.2.6 RNA干擾載體轉(zhuǎn)化木薯及nptII的PCR驗(yàn)證及QPCR檢測(cè) 將1.2.4中獲得的干擾載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，獲得含有干擾載體的農(nóng)桿菌菌株，然后侵染木薯TMS60444脆性胚愈傷，通過(guò)共培養(yǎng)，洗菌，誘導(dǎo)，最后獲得具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因木薯苗。具體方案參照文獻(xiàn)[19-20]。將生根篩選出的轉(zhuǎn)基因木薯苗提取基因組DNA，通過(guò)PCR的方法進(jìn)行nptII的鑒定。利用Mechlppdk QPCR引物對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Mechlppdk的表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mechlppdk在木薯不同組織器官的表達(dá)分析

如圖2，通過(guò)對(duì)180天的木薯根、莖和葉3個(gè)器官中Mechlppdk基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Mechlppdk在葉片中表達(dá)量最高，達(dá)到內(nèi)參基因的50%，莖中只有可見(jiàn)的少量表達(dá)，根中沒(méi)有表達(dá)。說(shuō)明Mechlppdk主要在葉片中起作用。

圖2 Mechlppdk在根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量

2.2 Mechlppdk干擾載體特異序列的選擇

將JGI網(wǎng)站公布的Mechlppdk(Manes.03G188300)，經(jīng)BLAST，選擇轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)一段保守序列，自第1個(gè)堿基至165個(gè)堿基，共165個(gè)堿基。具體序列信息如圖3A。將正反序列中間連接pHANNIBAL的內(nèi)含子，預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖3B，形成典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

圖3 木薯Mechlppdk siRNA設(shè)計(jì)

2.3 Mechlppdk RNA干擾片段的克隆

通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到175 bp左右的目的片段（包含酶切位點(diǎn)序列），見(jiàn)圖4A，將目的片段連接至pMD-18T克隆載體上，通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)氨芐篩選獲得陽(yáng)性菌落，通過(guò)PCR鑒定，結(jié)果顯示得到的小片段與預(yù)期大小一致（圖4 B）。將陽(yáng)性克隆送測(cè)序，選擇與Mechlppdk選定序列完全一致的克隆，提取質(zhì)粒，分別命名為pMechlppdkiXE和pMechlppdkiCX，用于下步構(gòu)建。

2.4 Mechlppdk RNA干擾中間載體的構(gòu)建

首先用EcoR I/Xho I分別酶切pMechlppdkiXE和pHANNIBAL，電泳，分別膠回收小，大片段，并用T4DNA連接酶將目的片段和載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在帶有氨芐的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖5A，經(jīng)EcoR I/Xho I雙酶切后，獲得與圖4中PCR擴(kuò)增大小一致的條帶，將該陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pHANNIBAL-MechlPPDKiXE。繼而用Cla I/XbaI雙酶切pHANNIBAL-MechlppdkiXE和pMechlppdkiCX，電泳，膠回收目的片段，用T4DNA連接酶連接載體和小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在篩選培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，PCR擴(kuò)增正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖5B，經(jīng)Cla I/Xba I雙酶切，在100 bp和250 bp的條帶之間有一條約170 bp的條帶，與圖4中PCR擴(kuò)增的條帶大小一致，酶切正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pHANNIBAL-MechlppdkiXE-CX.

圖4 Mechlppdk RNA干擾片段的擴(kuò)增及克隆鑒定

圖5 pHANNIBAL-MechlppdkiXE-CX中間載體酶切鑒定

2.5 Mechlppdk RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404

用Not I分別酶切pART27和pHANNIBALMechlppdkiXE-CX，電泳，膠回收目的片段和線(xiàn)性載體，用T4DNA連接酶將載體和目的片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在帶有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌液PCR（圖6A），將菌液PCR陽(yáng)性的克隆進(jìn)一步提取質(zhì)粒，Not I酶切，有8個(gè)克隆可切出與預(yù)期大小一致條帶，結(jié)果見(jiàn)圖6B，此時(shí)即獲得pART27-MechlppdkRNAi。將 pART27-MechlppdkRNAi轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，篩選培養(yǎng)基上獲得陽(yáng)性克隆，并經(jīng)PCR和質(zhì)粒酶切檢測(cè)為陽(yáng)性。

圖6 pART27-MechlppdkRNAi的分子鑒定

2.6 pART27-MechlppdkRNAi轉(zhuǎn)基因木薯苗的獲得

將獲得的帶有干擾載體的LBA4404侵染木薯品種TMS60444的脆性胚愈傷，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，篩選，獲得具有卡那霉素抗性苗。轉(zhuǎn)基因結(jié)果如圖7?？剐悦绶胖迷谔砑佑?0 μg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根篩選，如圖7D，7～9天部分轉(zhuǎn)基因植株在抗性培養(yǎng)基上生根，野生型沒(méi)有生根。繼而選擇生根的株系進(jìn)行卡那霉素Npt II的PCR鑒定，成功擴(kuò)增到目的條帶，如圖7E。最終獲得7個(gè)Mechlppdk的干擾株系。

圖7 轉(zhuǎn)pART27-MechlppdkRNAi木薯苗的誘導(dǎo)及鑒定

對(duì)上述獲得的7個(gè)轉(zhuǎn)基因木薯株系考察Mechlppdk基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖8。7個(gè)株系中有4個(gè)株系(1，2，3，7)的Mechlppdk的表達(dá)量大幅下調(diào)，其中最大的有7號(hào)株系，Mechlppdk的表達(dá)量下調(diào)到野生型的9.7%。有2個(gè)株系的Mechlppdk的表達(dá)量有輕微下調(diào)，表達(dá)量分別下調(diào)到野生型的87%和74%。

圖8 Mechlppdk干擾株系Mechlppdk的相對(duì)表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

RNAi是由雙鏈RNA分子在細(xì)胞內(nèi)干擾同源基因表達(dá)下調(diào)或沉默的技術(shù)[21]。RNA干擾最早追溯到1990年，Napoli等[22]在將查耳酮合酶基因(chs)轉(zhuǎn)入牽牛花中意外發(fā)現(xiàn)的。RNAi能夠定向關(guān)閉生物體內(nèi)的某一基因，使其不發(fā)揮作用，同時(shí)不影響其他基因，方便人們對(duì)特定基因功能的研究[23]。當(dāng)前廣為應(yīng)用的還有crisp技術(shù)，是在DNA水平敲除目的基因，效率高，但對(duì)于重要的功能基因，完全敲除后，往往具有植株致死性。而RNAi技術(shù)可以不同程度的干擾目的基因的表達(dá)，對(duì)于研究重要功能基因具有優(yōu)勢(shì)。但是RNAi的特異性是相對(duì)的，在某些情況下，siRNA能在翻譯水平抑制與之不完全相關(guān)的基因表達(dá)即脫靶效應(yīng)。為了應(yīng)對(duì)此類(lèi)脫靶現(xiàn)象，應(yīng)該針對(duì)同一基因多設(shè)計(jì)幾個(gè)靶點(diǎn)，以確保靶基因表達(dá)的有效抑制[24]。本研究共獲得7個(gè)Mehlppdk的干擾株系，其中3個(gè)株系Mechlppdk的表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明本次對(duì)Mechlppdk干擾操作有效。

雙子葉植物中，ppdk由單基因編碼[25]，5’有兩個(gè)不同的啟動(dòng)子分別產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體定位的轉(zhuǎn)錄本[26]。木薯ppdk同樣有2個(gè)啟動(dòng)子，分別產(chǎn)生葉綠體定位的Mechlppdk和細(xì)胞質(zhì)定位的Mecyppdk。前期研究發(fā)現(xiàn)Mecyppdk完全嵌套在Mechlppdk里面，所不同的是Mechlppdk的5’多一轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，具有組織特異性，主要在葉綠體表達(dá)[27]。本研究為更準(zhǔn)確的干擾Mechlppdk基因，選擇了該基因的5’轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)進(jìn)行干擾載體的構(gòu)建，最大限度的減少對(duì)Mecyppdk基因的干擾。目前尚未看到關(guān)于木薯Mechlppdk基因功能的研究報(bào)道。Zhang等[28]獲得了chlppdk功能缺失的玉米突變體，該材料的葉片在種植108 h后出現(xiàn)白化，且消耗完種子內(nèi)存活的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就會(huì)死亡。表明chlPPDK對(duì)于玉米的生存至關(guān)重要。接下來(lái)將利用獲得的干擾突變體展開(kāi)生理生化和分子生物學(xué)研究，以期闡明chlPPDK對(duì)木薯生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

本研究通過(guò)QPCR發(fā)現(xiàn)Mechlppdk在木薯葉片中具有較高的表達(dá)，達(dá)到內(nèi)參基因的50%；通過(guò)構(gòu)建木薯Mechlppdk的干擾載體轉(zhuǎn)化木薯，獲得7個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，其中3個(gè)株系較大幅度的降低了Mechlppdk的表達(dá)，最低的僅是本底chlppdk的9%。這些轉(zhuǎn)基因干擾株系將為Mechlppdk功能研究提供非常有利的實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)能夠部分闡述光合C4固定對(duì)木薯生長(zhǎng)發(fā)育的影響。