瑞香素對去卵巢大鼠炎性因子和骨代謝的影響

姬笑顏 李含笑 楊艷妮 張欣怡 蘇明莉 劉西紡，3△

骨質疏松癥是以骨量減少，骨微組織結構破壞，導致骨骼脆性增加，骨折的發(fā)生率增高為特征的全身性骨病[1]。骨質疏松癥由遺傳、營養(yǎng)、性腺功能減退、增齡等多種因素引起，機體免疫功能障礙與全身炎癥激活也被證實與骨質疏松癥的發(fā)病密切相關，因此抗炎和免疫調節(jié)成為治療骨質疏松癥的新思路[2-5]。瑞香素(Daphnetin，DAP)又名祖師麻甲素，是從長白瑞香等瑞香科屬植物中提取出來的香豆類衍生物，是一種具有抗炎作用的天然藥物，傳統(tǒng)多用于稀痘、乳癰初起等炎性疾病的治療[6]。瑞香素在骨質疏松癥治療中的作用尚未見報道，本課題組在前期的體外研究中發(fā)現(xiàn)瑞香素對骨髓源性巨噬細胞(BMM)來源的破骨細胞形成有明顯的抑制作用，而且能抑制RANKL誘導的巨噬細胞 NF-κB、Akt/GSK-3β途徑的活化，表明瑞香素對RANKL誘導的破骨細胞生成具有抑制作用[7]，且瑞香素在其他相關疾病的治療中發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)等作用[8-13]。本研究擬觀察瑞香素對絕經后骨質疏松大鼠的炎性因子和骨代謝指標的影響，以進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物

健康清潔級SD大鼠60只，雌性，體質量(220±20)g，西安交通大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為SCXK(陜)2018-001。

1.2實驗藥物及試劑

瑞香素膠囊購自吉林省西點藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，國藥準字H22024043，產品批號為03190101，規(guī)格0.15 g/粒。阿侖膦酸鈉片購自杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20130085，生產批號為S016727，規(guī)格70 mg/粒。羥甲基纖維素鈉購自湖北遠成賽創(chuàng)科技有限公司。Ca、P、ALP、IL-6、TNF-α檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3實驗儀器

雙能X線骨密度儀(ASY-00409)，美國Hologic公司。Multiskan FC型酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.4方法

1.4.1造模方法 除空白組外，均進行去勢造模，用5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，劑量為0.6 mL/100 g，消毒進行注射，待麻藥起效大鼠進入麻醉狀態(tài)后在無菌條件下行背部單切口入路卵巢切除術。背部備皮消毒，用剪刀在背部正中肋弓下1 cm與背部后正中線的交點切開長約1～2 cm縱行切口，找到卵巢(腎臟后下方脂肪組織周圍粉紅色樣組織)，分離卵巢周圍脂肪組織，結扎輸卵管及血管后將卵巢切除，后逐層縫合，在傷口處皮下注射青霉素預防感染，右側手術同左側，最后檢查止血，清點手術器械。造模后8周開始進行藥物干預。

1.4.2分組方法 實驗動物用隨機數(shù)字表法分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組、模型組、空白組6個實驗組，每組10只。按照常規(guī)籠養(yǎng)，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.4.3干預方法 根據(jù)設計的藥物劑量和體積，稱取適量的藥粉，用0.5%的羥甲基纖維素鈉懸浮并稀釋至合適的濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。低劑量組、中劑量組、高劑量組分別予以瑞香素0.275、 0.463、0.668 mg/kg灌胃，1次/d；對照組阿侖膦酸鈉劑量0.630 mg/kg，1次/周；模型組0.9%生理鹽水0.668 mg/kg灌胃；空白組不干預；連續(xù)給藥12周。實驗過程中每周稱1次體質量，根據(jù)體質量調整給藥劑量。

1.4.4實驗指標測定 1)骨密度檢測：將大鼠麻醉后，仰臥位測全身骨密度。2)血清IL-6、TNF-α、Ca、P、ALP的表達檢測：用5%水合氯醛，0.6 mL/100 g將大鼠麻醉，仰臥固定在手術架上，沿腹正中線皮膚切開腹腔，使腹主動脈清楚暴露。用采血針快速采全血約5 mL，靜置30 min，4 ℃，3 000 r/min離心20 min分離血清，使用生化試劑盒和ELISA試劑盒，按照說明書進行檢測。

1.5統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1造模前后各組大鼠的一般情況對比

本實驗選用去卵巢法模擬絕經后骨質疏松模型，7～12周即可形成模型[13]。造模前各組大鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，造模8周后各組大鼠體質量與空白組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2各組大鼠間BMD比較

治療前空白組大鼠BMD高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后各組大鼠的BMD均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組、對照組的BMD治療后均高于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 治療前后各組大鼠BMD變化

2.3瑞香素對各組大鼠炎性因子的影響

低劑量組、高劑量組和空白組IL-6含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組和模型組的IL-6含量均高于空白組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組、高劑量組、對照組和空白組TNF-α的含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組、中劑量組和模型組的TNF-α含量均高于空白組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 瑞香素對各組大鼠炎性因子的影響

2.4各組大鼠血清Ca、P、ALP表達的比較

高劑量組Ca含量高于對照組和模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組、高劑量組P含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中劑量組、高劑量組、對照組ALP含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組ALP含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清Ca、P、ALP表達的比較

3 討論

3.1骨質疏松癥和BMD

骨質疏松的發(fā)生是骨形成和骨吸收之間的失衡，吸收超過形成引起骨量的減少BMD降低，BMD是反映骨骼強度的重要指標[14]。本研究發(fā)現(xiàn)瑞香素灌胃后各組大鼠的BMD均高于模型組(P<0.05)。除了模型組，其余各組大鼠的BMD治療后均高于治療前，瑞香素高劑量組、對照組大鼠的BMD治療后高于治療前(P<0.05)，可見高劑量的瑞香素可有效提高大鼠的BMD，增強骨骼強度，延緩骨質疏松的進程。

3.2炎性因子與骨質疏松癥

炎癥是疾病發(fā)生發(fā)展的重要生物學過程，女性絕經后失去雌激素保護，大量的炎性因子積累，如IL-6、TNF-α、IL-12等，這些炎性細胞因子可調節(jié)氧化應激損傷，引起破骨細胞骨吸收增強，導致骨重建失衡[15-17]。IL-6作用于成骨細胞的基質細胞，刺激破骨細胞形成，增加并增強破骨細胞活性，促進骨吸收，進而參與到骨質疏松的形成過程[18]。巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)在破骨細胞前體分化為成熟的破骨細胞的過程中發(fā)揮重要作用，TNF-α可直接或間接促進M-SCF的產生，作用于破骨細胞加速骨吸收，并使成骨的凋亡加快，減少骨的合成，且在骨質疏松性疼痛中發(fā)揮重要作用[19-20]。代嬋等[21]發(fā)現(xiàn)瑞香素在TNF-α誘導的CIA大鼠成纖維樣滑膜細胞(FLS)中NF-κB信號通路活化，降低NF-κB信號通路中P65的磷酸化水平，調節(jié)相關炎癥因子的分泌，減少炎癥反應。何榮安等[22]發(fā)現(xiàn)瑞香素可通過NF-κB信號通路抑制p65的磷酸化，減弱TNF-α刺激的HaCaT角質形成細胞炎癥因子的表達。本研究發(fā)現(xiàn)在瑞香素干預12周以后低劑量組、高劑量組、空白組IL-6含量均低于模型組(P<0.01)，低劑量組、高劑量組、對照組和空白組TNF-α的含量均低于模型組(P<0.05)，也進一步證明了瑞香素可緩解絕經后骨質疏松大鼠的炎癥反應，改善骨痛，進而對大鼠的骨代謝產生影響。

3.3瑞香素對骨代謝的影響

骨代謝生化指標包括骨轉換標志物、鈣磷代謝指標、激素與細胞因子，通過骨代謝生化指標可了解骨組織代謝[23]。骨組織中鈣、磷的含量是維持骨組織強度的基礎，血清中鈣、磷的含量是反映全身骨組織代謝的重要指標。ALP是參與骨代謝的重要蛋白，可直接反映成骨細胞的活性和功能狀況，亦與鈣磷的代謝具有密切關系[24]。本研究結果顯示瑞香素高劑量組Ca含量高于對照組和模型組(P<0.05)。低劑量組、高劑量組P含量均高于模型組(P<0.05)；低劑量組、高劑量組、對照組P含量均高于空白組(P<0.05)。可見瑞香素可在一定程度上提高骨質疏松大鼠骨組織中的鈣磷含量，從而增強骨組織的強度。諶紅珊等[25]研究發(fā)現(xiàn)骨質疏松患者的ALP水平與BMD呈負相關。本研究發(fā)現(xiàn)瑞香素中劑量組、高劑量組ALP含量均低于模型組(P<0.05)，說明中、高劑量的瑞香素可降低去卵巢骨質疏松大鼠的ALP含量，提高其鈣磷含量，改善去卵巢骨質疏松大鼠的骨代謝水平。

綜上所述，瑞香素高劑量可提高絕經后骨質疏松大鼠的全身BMD，低劑量和高劑量的瑞香素均對IL-6、TNF-α有明顯的抑制作用，高劑量的瑞香素可提高血清Ca的含量，中、高劑量的瑞香素可提高血清P的含量，中、高劑量可有效降低ALP的含量進而可維持骨組織的強度，抑制骨質疏松的嚴重程度，這對臨床上治療絕經后骨質疏松提供了實驗基礎，但其具體的作用機制有待進一步的研究。