綜合評(píng)分法優(yōu)選葛根藥材產(chǎn)地加工方法*

唐成林，杜洪志，馮文豪，李 瑋▲，田 坤，蒙燕瑤，魏升華，嚴(yán)福林

(1貴州省農(nóng)業(yè)展覽館，貴州 貴陽(yáng) 550001；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；3貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站，貴州 貴陽(yáng) 550001)

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi 的干燥根，甘、辛、涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效[1]，始載于神農(nóng)本草經(jīng)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，葛根主要含有三萜皂苷、生物堿、異黃酮、多糖等多種成分[2]，具有抗氧化[3]、抗心律失常[4]、降血糖[5]、抗腫瘤[6]、保肝[7]等多種藥理活性。其中異黃酮類物質(zhì)，包括葛根素、大豆苷、大豆苷元等，是其降血糖、降血壓、改善心腦微循環(huán)、抗癌的主要有效成分[8]。2020年版《中國(guó)藥典》中葛根含量測(cè)定指標(biāo)為葛根素，但僅以葛根素為指標(biāo)并不能完全反映藥材的質(zhì)量。

產(chǎn)地加工是形成中藥品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，產(chǎn)地加工出現(xiàn)問(wèn)題，則會(huì)影響藥材質(zhì)量及臨床療效。2020版《中國(guó)藥典》 收載的葛根加工方法為“秋、冬二季采挖，趁鮮切成厚片或小塊，干燥”。該加工方法缺乏具體的工藝技術(shù)參數(shù)，使得葛根中主要化學(xué)成分因加工方法的不同而產(chǎn)生差異。截止目前，經(jīng)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究，有關(guān)不同產(chǎn)地加工方法對(duì)葛根藥材質(zhì)量的影響未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

基于此，為了保證葛根藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性和可控性，本文以葛根中葛根素、大豆苷、大豆苷元、水溶性浸出物、醇溶性浸出物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法研究不同產(chǎn)地加工方法對(duì)葛根藥材質(zhì)量的影響，優(yōu)選葛根的最佳產(chǎn)地加工方法，研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化葛根產(chǎn)地加工工藝、明確工藝技術(shù)參數(shù)及質(zhì)量控制提供重要參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ulti Mate3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；ME204E型萬(wàn)分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；CS101-1C型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)；HS10260D型超聲波清洗機(jī)(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；HH-2型恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、乙腈(色譜純，天津市科密歐有限公司)；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純；葛根素對(duì)照品(貴州迪大科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：GZDD-0029)；大豆苷對(duì)照品(貴州迪大科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：GZDD-0144)；大豆苷元對(duì)照品(貴州迪大科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：GZDD-0077)。

葛根采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi 的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 產(chǎn)地加工方法

方法一：取葛根新鮮藥材，洗凈泥土，除去雜質(zhì)，刮去外皮，趁鮮切成厚片(2～4 mm)、塊(1～2 cm)或段(2～4 cm，4～6 cm)，再曬干、陰干或60 ℃烘干。

方法二：取葛根新鮮藥材，洗凈泥土，除去雜質(zhì)，刮去外皮，趁鮮切成丁塊(1～2 cm)，再50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃烘干。

2.2 供試品溶液的制備

取葛根藥材粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入10%的乙醇50 mL，稱重，回流提取0.5 h，放冷，補(bǔ)重，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取葛根素1.00 mg、大豆苷0.50 mg、大豆苷元0.47 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻使其完全溶解，即得葛根素0.100 mg·mL-1、大豆苷0.050 mg·mL-1、大豆苷元0.047 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 水溶性及醇溶性浸出物的含量測(cè)定

按照2020年版《中國(guó)藥典》第四部通則2201浸出物測(cè)定方法(熱浸法)對(duì)樣品進(jìn)行水溶性浸出物、醇溶性浸出物測(cè)定，并計(jì)算百分含量。

2.5 葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，27%A，10～35 min，27%～40%A，35～45 min，40%～60%A，45～50 min，60%～27%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)不低于4000。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 葛根素、大豆苷、大豆苷元對(duì)照品及樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances andsamples of puerarin，daidzin and daidzein

2.5.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3”項(xiàng)下不同體積的葛根素、大豆苷、大豆苷元對(duì)照品溶液，加入甲醇溶液進(jìn)行稀釋，配制成不同濃度的葛根素、大豆苷、大豆苷元對(duì)照品溶液。在“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，分別得：

葛根素回歸方程Y=1325.1X+0.3549

r2=0.9999，線性濃度范圍：5.00～90.00 μg·mL-1

大豆苷回歸方程為Y=1139.6X+0.4177

r2=0.9999，線性濃度范圍：2.50～4.50 μg·mL-1

大豆苷元回歸方程為Y=673.35X+0.3783

r2=0.9999，線性濃度范圍：2.35～42.30 μg·mL-1

2.5.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定6次，得到葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD值分別為1.90%、2.76%、2.70%，表明儀器的精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一葛根樣品粉末6份，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分別為1.64%、0.81%、1.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分別為1.48%、1.56%、2.13%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批葛根藥材粉末6份，每份約0.05 g，加入適量對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果葛根素、大豆苷、大豆苷元平均回收率分別為99.78%、100.58%、98.94%，RSD值分別為2.54%、2.88%、2.10%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.6 產(chǎn)地加工方法的優(yōu)選

綜合評(píng)分法主要用于多指標(biāo)質(zhì)量控制，是一種引入一個(gè)綜合指標(biāo)“隸屬度”，將多項(xiàng)指標(biāo)變?yōu)橥欢攘恐?，通過(guò)“給分”進(jìn)行綜合評(píng)優(yōu)的數(shù)量分析方法[9]。

基于此，為了客觀評(píng)價(jià)不同加工方法對(duì)葛根藥材質(zhì)量的影響，本文主要采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選葛根的加工方法，其中，葛根素、大豆苷、大豆苷元、水溶性浸出物、醇溶性浸出物均為內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，都是越高越好。因此，在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)，引入一個(gè)綜合指標(biāo)“隸屬度”，將各指標(biāo)進(jìn)行“隸屬度”計(jì)算，即指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)值-指標(biāo)最小值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)；可見(jiàn)，指標(biāo)最大值的隸屬度為1，而最小值隸屬度為0，所以0≤指標(biāo)隸屬度≤1。根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》相關(guān)質(zhì)控指標(biāo)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)中各指標(biāo)藥理作用及含量，將權(quán)重分配為葛根素占40%、大豆苷占20%、大豆苷元占15%、醇溶性浸出物占15%、水溶性浸出物占10%。

綜合分?jǐn)?shù)=葛根素隸屬度×40%+大豆苷隸屬度×20%+大豆苷元隸屬度×15%+醇溶性浸出物隸屬度×15%+水溶性浸出物隸屬度×10%，滿分為1.00，計(jì)算各樣品的綜合評(píng)分值。

精密稱取不同加工方法的葛根藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。計(jì)算各樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量，再根據(jù)《中國(guó)藥典》浸出物測(cè)定方法測(cè)定浸出物含量，結(jié)果均以干燥品計(jì)算。根據(jù)綜合評(píng)分計(jì)算方法計(jì)算綜合評(píng)分值。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地加工方法對(duì)葛根藥材質(zhì)量的影響(n=3)Tab.1 Effect of different processing techniques on the quality of Puerariae Lobatae Radix(n=3)

從表1可得出，不同產(chǎn)地加工方法對(duì)葛根的內(nèi)在質(zhì)量影響較大，綜合評(píng)分值較大的加工方法主要為趁鮮切厚片(2～4 mm)后曬干(0.81)>趁鮮切塊(1～2 cm)后60 ℃烘干(0.80)>趁鮮切塊(1～2 cm)后曬干(0.79)；而綜合評(píng)分值最低的加工方法為趁鮮切段(4～6 cm)后陰干(0.03)。同一干燥方式，曬干和陰干的綜合評(píng)分值以切段(2～4 cm)和切段(4～6 cm)較低，其中切段(4～6 cm)最低，結(jié)果表明若干燥時(shí)間較長(zhǎng)，藥材切制過(guò)厚，對(duì)其質(zhì)量影響較大。而同一切制規(guī)格下，隨著溫度升高，綜合評(píng)分值也逐漸增大，其中以90 ℃烘干為最大值，結(jié)果表明藥材的內(nèi)在質(zhì)量與干燥過(guò)程水分揮發(fā)速度密切相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)研究結(jié)果，葛根最佳的產(chǎn)地加工方法為：取原鮮品藥材，除去雜質(zhì)泥土，刮去外皮，趁鮮切厚片(2～4 mm)或塊(1～2 cm)后，曬干或60 ℃烘干，該方法能較好地控制葛根藥材的質(zhì)量。同時(shí)，若干燥時(shí)間較長(zhǎng)，藥材切制過(guò)厚，其內(nèi)在質(zhì)量較差，故葛根藥材切制時(shí)要注意厚度。而同一切制規(guī)格下，隨著溫度升高，綜合評(píng)分值也逐漸增大，結(jié)果表明，在一定的控制溫度下，盡快去除鮮品藥材的水分，有利于保證藥材的質(zhì)量。

葛根鮮品藥材中含有大量的水分，干燥難度較大，趁鮮切制方法直接影響著藥材的干燥速度，故產(chǎn)地加工工藝中切制規(guī)格及干燥方式是影響葛根藥材質(zhì)量的主要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嚴(yán)格控制切制規(guī)格及干燥方式是葛根產(chǎn)地加工的關(guān)鍵技術(shù)，也是影響葛根質(zhì)量的重要原因；陽(yáng)光下曬干不會(huì)影響葛根藥材的質(zhì)量，故產(chǎn)地加工時(shí)可以根據(jù)實(shí)際條件選擇曬干或烘干進(jìn)行干燥處理。

多成分、多指標(biāo)控制中藥材質(zhì)量已成為當(dāng)前發(fā)展新趨勢(shì)，也是中藥現(xiàn)代化發(fā)展進(jìn)程中的必然要求。本研究過(guò)程中，以葛根素、大豆苷、大豆苷元、水溶性浸出物、醇溶性浸出物作為指標(biāo)成分，采用綜合評(píng)分法對(duì)葛根的產(chǎn)地加工方法進(jìn)行優(yōu)選，所篩選的工藝操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，加工出的藥材色澤和品質(zhì)較好，綜合評(píng)分值較高，研究結(jié)果使葛根的質(zhì)量從源頭上得到了控制，優(yōu)選的產(chǎn)地加工方法對(duì)藥農(nóng)及企業(yè)規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化加工生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。該藥材不同加工方法是否與藥效試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)，有待進(jìn)一步的研究論證。