女貞種質(zhì)資源ISSR分析與抗寒優(yōu)株選育

姜楠南，孫 音，劉鳳欒，王 媛，盧 潔，楊傳祥，房義福

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院 園林與花卉所，山東 濟(jì)南 250014；2.上海辰山植物園中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心，上海 201602；3.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟(jì)南 250014；4.泰禾園林綠化有限公司，山東 日照 276800）

女貞Ligustrum lucidum為木犀科Oleaceae 女貞屬Ligustrum常綠闊葉小喬木，其樹形優(yōu)美、葉片光亮、果實(shí)累累，具有良好的園林應(yīng)用價值和較高的藥用價值[1]。女貞原產(chǎn)于我國長江流域及其以南的華南、西南地區(qū)，分布廣泛，西北至陜西、甘肅，東到江蘇，朝鮮也有分布[2]。女貞適應(yīng)性強(qiáng)，對低溫低濕環(huán)境及鉛、鉻、鋅、二氧化硫等污染具有較強(qiáng)的耐受性[3]。由于其葉片大且光亮、經(jīng)冬不落，近年來被大量引種到我國黃河中下游地區(qū)，是山東、河南、河北等黃河中下游地區(qū)為數(shù)不多的常綠闊葉喬木樹種，在隆冬時節(jié)其觀賞性狀突出。但是引入山東及其周邊地區(qū)后易受凍害，表現(xiàn)為冬末全部或大部分葉片枯黃脫落并保持落葉狀態(tài)，直至來年新葉萌生，甚至1年生枝條凍死或地上枝干全部凍死等。因而選育適應(yīng)北方地區(qū)氣候的抗寒女貞優(yōu)株，對于華北地區(qū)的生態(tài)建設(shè)和綠化美化具有十分重要的意義。

近年來，關(guān)于女貞抗寒性鑒定方法及生理生化指標(biāo)測定的研究多有報道。林艷等[4]、李忠喜等[5]以相對電導(dǎo)率為指標(biāo)篩選抗寒女貞；郝明灼等[6]對4 個女貞品種盆栽苗抽梢展葉期的抗寒性進(jìn)行研究，利用Logistic 方程擬合得出女貞的低溫半致死溫度為-5.69 ℃。植物在不同物候期的抗寒能力存在較為明顯的差異[7]。楊曉玲等[8]對3 種女貞的葉片抗寒、抗旱生理指標(biāo)進(jìn)行了研究，認(rèn)為女貞的抗低溫和抗干旱能力較強(qiáng)。林艷等[9]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，相對較高的溫度和濕度可降低女貞主干抽梢率，增強(qiáng)女貞的抗寒性能。上述文獻(xiàn)均以電導(dǎo)率為指標(biāo)研究了不同品種、不同樹齡、不同環(huán)境條件下女貞的抗寒性?？购允侵参镌趯Φ蜏氐拈L期適應(yīng)中通過本身的變異和自然選擇獲得的一種遺傳特性。女貞的抗寒性由其在低溫脅迫下的生理調(diào)節(jié)能力決定，生理調(diào)節(jié)能力與植株的遺傳特性、解剖結(jié)構(gòu)、環(huán)境及當(dāng)年生長發(fā)育情況等有關(guān)[10]。前期研究結(jié)果表明，部分抗寒女貞優(yōu)株的抗寒表現(xiàn)不穩(wěn)定，可塑性較大。目前，對女貞抗寒穩(wěn)定性進(jìn)行多年連續(xù)觀測的研究報道較少，將抗寒表型與生理指標(biāo)、解剖、遺傳相結(jié)合的研究鮮見報道。

本課題組連續(xù)多年觀察篩選引入的女貞，淘汰凍死凍傷女貞種質(zhì)，初步篩選出抗寒表現(xiàn)較好的60 份女貞種質(zhì)。由于女貞抗寒表現(xiàn)具有不穩(wěn)定性，為了從中篩選出抗寒性強(qiáng)且穩(wěn)定的女貞種質(zhì)，課題組對初選的60 份女貞種質(zhì)，在連續(xù)調(diào)查其露地越冬表現(xiàn)的同時，采集具有不同抗寒表現(xiàn)的葉片觀察葉脈和葉肉的解剖結(jié)構(gòu)，采集1年生枝條測定電導(dǎo)率，計(jì)算脅迫條件下的低溫半致死溫度，綜合評價各女貞種質(zhì)的抗寒能力。采用ISSR（inter-simple sequence repeats）分子標(biāo)記的方式，對60 份女貞種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，將女貞種質(zhì)的聚類結(jié)果和抗寒能力進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于山東省濟(jì)南市長清區(qū)（116°63′E，36°38′N）。2016年，平均氣溫13.8 ℃，年平均降水量623.1 mm，無霜期186 d，1月平均氣溫-3.2 ℃，極端最低氣溫-16 ℃（1月20日）。

1.2 供試材料

從山東、河南、河北、四川等地栽植的女貞中收集抗寒種質(zhì)資源共185 份，2010年進(jìn)行嫁接繁殖，2011年定植在長清區(qū)試驗(yàn)地。2017年，選擇不同來源且具有代表性的60 份材料作為試驗(yàn)材料（表1）。其中，D5、D6、D7 為B3 的實(shí)生苗后代。

表1 60 份女貞種質(zhì)材料及其來源Table 1 60 germplasm materials of L.lucidum and their origins

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 女貞抗寒表型觀測

2011—2017年的每年3月（女貞換葉期），調(diào)查女貞露地越冬表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)主干、枝條受凍情況和葉片枯落情況。

1.3.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察

2017年1月，采集各女貞種質(zhì)材料的葉片，采用石蠟切片法[11]制作切片，切片厚度8 μm，番紅-固綠染色，使用奧林巴斯B50 顯微鏡觀察并拍照。比較葉片主葉脈、柵欄組織和海綿組織等的差異，分析其與抗寒能力的相關(guān)性。

1.3.3 相對電導(dǎo)率測定及低溫半致死溫度計(jì)算

2017年11月初，采集各女貞種質(zhì)材料相對飽滿健壯的1年生休眠枝條，剪成10 cm 長度，隨機(jī)分成5 份，裝入自封袋中，于4 ℃條件下平衡24 h，然后分別置于0、-5、-10、-15 和-20 ℃條件下處理12 h。每份樣品避開兩端及芽眼，剪成約0.3 cm 長度枝段，室溫下浸提12 h 后，測定初電導(dǎo)值（S1），煮沸30 min，冷卻至室溫后，測定終電導(dǎo)值（S2）。室溫下測定去離子水電導(dǎo)值（S0）[12]，計(jì)算相對電導(dǎo)率（SR）。

SR= [(S1-S0)/(S2-S0)]×100%。

古人說，心安茅屋穩(wěn)，性定菜根香，心安即是福。是的，抬腿之勞，一個小小過失的彌補(bǔ)，便能讓人心安，便能讓人感念生活，感悟人生，便能讓世界充滿愛，于人于己都是滿滿的正能量，何樂而不為呢？！

使用SPSS 軟件擬合Logistic 回歸方程

y=k/(1+ae-bt)。

式中：y為相對電導(dǎo)率，x為處理溫度，k為常數(shù)。計(jì)算相對電導(dǎo)率的拐點(diǎn)溫度lna/b，即低溫半致死溫度[13]。

1.3.4 ISSR 分子標(biāo)記及聚類

采用改良的CTAB 法[14]抽提各女貞種質(zhì)材料的總基因組DNA，采用ISSR 分子標(biāo)記的方法，使用優(yōu)化的ISSR-PCR 反應(yīng)體系[15]，對96 條哥倫比亞大學(xué)開發(fā)的通用引物進(jìn)行篩選用于PCR 擴(kuò)增。使用POPGENE 軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率。

將電泳圖譜同一位置清晰出現(xiàn)的條帶記為“1”，無條帶記為“0”，將條帶信息轉(zhuǎn)換成“0”和“1”組成的原始矩陣，使用NTSYSpc-2.11F 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對原始矩陣用SimQual 程序求DICE 相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。依據(jù)Nei’s 遺傳距離，采用SHAN 程序中的UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析，通過Tree plot 模塊生成聚類圖，構(gòu)建各種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 各女貞種質(zhì)材料的抗寒表型分級

2014—2017年，每年11月15日—次年3月15日長清區(qū)日最低溫度變化如圖1所示。

圖1 2014—2017年女貞越冬期間長清區(qū)日最低溫度的變化Fig.1 Daily mininmum temperature changes of Changqing district sites during the L.lucidum through winter from 2014 to 2017

表2 60 份女貞種質(zhì)材料抗寒表型分級Table 2 Classification of cold resistant phenotype of 60 L.lucidum germplasm materials

2.2 各女貞種質(zhì)材料的葉片解剖結(jié)構(gòu)

選擇越冬葉片保有率較高的女貞種質(zhì)A4、A5和越冬葉片保有率較低的女貞種質(zhì)K1、K3，觀察其葉片主脈解剖結(jié)構(gòu)，如圖2所示。由圖2可見，具有較高與較低越冬葉片保有率種質(zhì)的主葉脈結(jié)構(gòu)無顯著差異，其木質(zhì)部、韌皮部細(xì)胞層數(shù)接近，細(xì)胞大小及排列方式較為相似。

圖2 具有不同越冬葉片保有率女貞種質(zhì)的葉片主脈解剖結(jié)構(gòu)Fig.2 Anatomical structure of leaf main veins of L.lucidum germplasm with different leaf retention rates over winter

選擇越冬葉片保有率較高的女貞種質(zhì)A4、A5和越冬葉片保有率較低的女貞種質(zhì)K1、K3，觀察其葉肉組織解剖結(jié)構(gòu)，如圖3所示。由圖3可見，越冬葉片保有率較高的女貞種質(zhì)A4、A5，其葉片的柵欄組織和海綿組織在細(xì)胞層數(shù)、細(xì)胞排列緊密度、細(xì)胞完整度等方面顯著優(yōu)于越冬葉片保有率較低的女貞種質(zhì)K1、K3。

圖3 具有不同越冬葉片保有率女貞種質(zhì)的葉肉組織解剖結(jié)構(gòu)Fig.3 Anatomical structure of mesophyll tissue of L.lucidum germplasm with different leaf retention rates over winter

抗寒種質(zhì)A4 的葉片柵欄組織多達(dá)3 層，柵欄組織厚度達(dá)425.2 μm，細(xì)胞完整性高、排列緊密，海綿組織細(xì)胞解體少、排列緊密，海綿組織厚度297.5 μm，柵欄組織和海綿組織厚度的比值為1.43。越冬葉片保有率較低的種質(zhì)K3 的葉片柵欄組織厚度僅為198.6 μm，海綿組織細(xì)胞排列疏松，海綿組織厚度達(dá)435 μm，柵欄組織和海綿組織厚度的比值為0.46。

2.3 各女貞種質(zhì)材料的低溫半致死溫度

以60 份女貞種質(zhì)1年生枝為材料，測定相對電導(dǎo)率，推導(dǎo)Logistic 回歸方程，計(jì)算低溫半致死溫度，結(jié)果見表3。由表3可知，60 份女貞材料的低溫半致死溫度與其抗寒表現(xiàn)較為相符，其中種質(zhì)A4 的低溫半致死溫度最低，為-15.1 ℃。

表3 60 份女貞種質(zhì)材料的低溫半致死溫度Table 3 Semi-lethal low temperature of 60 L.lucidum materials ℃

2.4 各女貞種質(zhì)材料的ISSR 分子標(biāo)記和聚類分析

2.4.1 ISSR 引物篩選及擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

從96 條ISSR 引物中篩選出9 條擴(kuò)增條帶較完整、清晰、多態(tài)性豐畗的引物，分別為UBC807、UBC808、UBC810、UBC811、UBC836、UBC840、UBC880、UBC881 和UBC886。所篩選9 條ISSR 引物對60 份女貞種質(zhì)材料的擴(kuò)增結(jié)果見表4。由表4可知，這9 條引物的平均擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為224，多態(tài)性位點(diǎn)比率達(dá)100%。多態(tài)性水平無明顯差異，擴(kuò)增的DNA片段集中在200～1 000 bp，60 份女貞種質(zhì)材料的Nei’s 基因多樣性指數(shù)為0.116 3～0.172 1，平均為0.143 8；Shannon 信息指數(shù)為0.206 0～0.295 3，平均為0.254 5。

表4 所篩選9 條ISSR 引物對60 份女貞種質(zhì)材料的擴(kuò)增結(jié)果Table 4 Amplification results of the 9 ISSR primers to 60 L.lucidum materials

使用這9 條引物擴(kuò)增出的DNA 片段長度基本相同，重復(fù)性較高，說明引物的重復(fù)性好，可以用于遺傳多樣性分析。其中，引物UBC808 多態(tài)性擴(kuò)增效果最好（圖4），其次是UBC836。

圖4 使用引物UBC808 擴(kuò)增的60 份女貞種質(zhì)材料的ISSR 圖譜（PAGE）Fig.4 ISSR map of 60 L.lucidum germplasm materials amplified with primer UBC808（PAGE）

2.4.2 ISSR 標(biāo)記聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，對60 份女貞種質(zhì)材料進(jìn)行UPGMA聚類，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，以相似系數(shù)0.298 為界，可將供試樣品分為i 和ii 2 大類。i 類中，A8、A10 首先聚在一起，之后與A12、A14 聚在一起，然后與A4、A5 以及A3 聚在一起，A11 和K12 相聚再與前面的種質(zhì)聚在一起；B6、B8 親緣關(guān)系最近，然后與CX6 相聚；B9、B10 相聚再與B1 相聚。其余的種質(zhì)聚成ⅱ類。根據(jù)表1中女貞種質(zhì)來源可知，不同種源地的種質(zhì)可以聚在一起，如A8 和A10；同一種源地的種質(zhì)不一定聚在一起，同為鄢陵來源的A3、A4、A5聚在ⅰ類，A6、A7 聚在ⅱ類。

圖5 60 份女貞種質(zhì)材料基于ISSR 的遺傳相似性的UPGMA 聚類Fig.5 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 60 L.lucidum materials

3 結(jié)論與討論

女貞葉肉組織顯微結(jié)構(gòu)、低溫半致死溫度和抗寒表型觀測結(jié)果均顯示優(yōu)株A4 的抗寒性強(qiáng)且穩(wěn)定，是良好的抗寒女貞育種材料。供試女貞材料的ISSR 聚類結(jié)果反映了其親緣關(guān)系，也表明不能按照優(yōu)株地理距離聚類。ISSR 聚類結(jié)果與抗寒性表現(xiàn)相符，表明親緣關(guān)系近的女貞種質(zhì)具有相似的抗寒表現(xiàn)。

3.1 ISSR 聚類分析

趙峰等[16]將RAPD 技術(shù)應(yīng)用于女貞種內(nèi)遺傳多樣性分析，將7 個居群的121 份女貞材料按照地理來源分為4 大類群。李傳代[17]應(yīng)用ISSR 分子標(biāo)記將66 份女貞種質(zhì)分為4 類，親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與地理位置遠(yuǎn)近的格局不完全吻合。本試驗(yàn)中60份女貞供試材料來自河南、山東、河北、四川等地，ISSR 聚類結(jié)果顯示大部分女貞種質(zhì)可按照地域聚在一起，但存在不同取樣地的女貞材料未按照地理距離聚類的情況，親緣關(guān)系與取樣地域不完全吻合。D5、D6、D7 均為B3 結(jié)實(shí)播種所得后代，親緣關(guān)系近，聚在一起，說明ISSR 聚類結(jié)果反映了其親緣關(guān)系，印證了ISSR 聚類的可信性。本試驗(yàn)中取樣材料雖然來自不同省份，但這些省份大多數(shù)不是女貞的原產(chǎn)地，當(dāng)?shù)嘏懚嗍亲酝獾匾N而來。李傳代等[15]從云南、貴州、江西、湖南、江蘇女貞居群中取樣，得到的Nei’s 基因多樣性指數(shù)均值為0.200 5，Shannon 信息指數(shù)均值為0.315 1，這2 個衡量遺傳多樣性的指標(biāo)均高于本試驗(yàn)結(jié)果。表明本試驗(yàn)中所選取女貞種質(zhì)材料間的遺傳變異小于野生分布種群，這與試驗(yàn)取樣不是來自野生居群有關(guān)，這在高粱[18]、向日葵[19]、大豆[20]等物種上得到證實(shí)。

3.2 抗寒女貞優(yōu)株篩選

大量研究結(jié)果表明，采用電導(dǎo)法測定一系列溫度下植物組織的電導(dǎo)率，采用Logistic 方程進(jìn)行回歸分析，通過計(jì)算得到的植物組織低溫半致死溫度可以作為抗寒性指標(biāo)[4-5,21-23]。本試驗(yàn)中通過比較不同女貞材料枝條的低溫半致死溫度，發(fā)現(xiàn)其抗寒性存在明顯差異，優(yōu)株A4 的低溫半致死溫度達(dá)到-15.1 ℃，而抗寒性較弱的種質(zhì)K1 的低溫半致死溫度為-4.2 ℃。除K1、K4 外，其余優(yōu)株均比朱鳳榮等[24]測定的河南新鄉(xiāng)女貞的低溫半致死溫度（-5.316 ℃）低，一定程度上說明本試驗(yàn)中所篩選優(yōu)株的抗寒性整體較強(qiáng)。葉片解剖結(jié)構(gòu)也是反映抗寒性的指標(biāo)[25]。優(yōu)株A4 休眠枝條的低溫半致死溫度為-15.1 ℃，與K1、K3 相比，其葉肉組織解剖結(jié)構(gòu)中柵欄組織細(xì)胞層數(shù)多、排列緊密，柵欄組織和海綿組織厚度的比值大，說明A4抗寒性強(qiáng)與葉片組織結(jié)構(gòu)有關(guān)。將ISSR 聚類結(jié)果與2015—2017年的抗寒表型觀測結(jié)果相比較可知，ISSR 聚類結(jié)果中，ⅰ類種質(zhì)的抗寒表型多為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，其中A4、A12 的抗寒表型為Ⅰ級，僅A14的抗寒表型為Ⅳ級。ⅱ類種質(zhì)的抗寒表型以Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級為多，也包括部分抗寒表型Ⅱ級的女貞種質(zhì)。將ISSR 聚類結(jié)果與低溫半致死溫度相比較可以看出，ⅰ類種質(zhì)包含15 個優(yōu)株，其中10 個優(yōu)株的低溫半致死溫度在-10 ℃以下，抗寒能力強(qiáng)，A4 的低溫半致死溫度最低，而ⅱ類種質(zhì)的低溫半致死溫度較高。結(jié)合2015—2017年女貞抗寒表型觀測結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，ⅰ類女貞種質(zhì)抗寒性較強(qiáng)，ⅱ類女貞種質(zhì)抗寒性較弱。在進(jìn)行抗寒女貞雜交育種時，應(yīng)選擇抗寒強(qiáng)的ⅰ類女貞種質(zhì)為親本。

盡管本試驗(yàn)中所選取抗寒指標(biāo)在多數(shù)情況下與抗寒表型觀測結(jié)果相符，但部分材料存在出入，如A12 的抗寒表型為Ⅰ級，但其低溫半致死溫度較高（-11 ℃），說明抗寒女貞篩選的復(fù)雜性，單憑幾年時間的觀測進(jìn)行抗寒優(yōu)株篩選，其結(jié)果不可靠。由于抗寒表型具有不穩(wěn)定的特點(diǎn)，各種抗寒性篩選指標(biāo)均有其局限性，單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確全面地反映植物的抗寒性[26]，將抗寒表型、生理指標(biāo)、植物組織結(jié)構(gòu)與由分子標(biāo)記得出的親緣關(guān)系相結(jié)合，來篩選抗寒女貞優(yōu)株，可增強(qiáng)篩選結(jié)果的可靠性，得出更為科學(xué)的結(jié)論。2016年1月，試驗(yàn)地最低溫度達(dá)到-19.7 ℃，優(yōu)株A4 的主干和1年生、2年生枝基本未受凍害，其余女貞地上部均呈現(xiàn)不同程度凍害。優(yōu)株A4 在自然極寒天氣的表現(xiàn)與低溫半致死溫度、葉片解剖結(jié)構(gòu)等抗寒指標(biāo)及ISSR 聚類結(jié)果相互印證，說明其抗寒性較強(qiáng)，可作為抗寒女貞種質(zhì)在華北地區(qū)推廣。

植物的抗寒性是其南種北引的主要限制因子，而植物是否真正適應(yīng)引種地環(huán)境，需要幾十甚至上百年時間的檢驗(yàn)。本研究雖持續(xù)7 a，但篩選出的抗寒常綠女貞優(yōu)株的抗寒表現(xiàn)仍有待時間的檢驗(yàn)。除種內(nèi)選育外，開展種間雜交育種是未來培育抗寒女貞優(yōu)株的研究方向。