隱丹參酮可能具有誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞鐵死亡的作用

劉金麗，佟 雷，羅 燁，高月娟

牡丹江醫(yī)學(xué)院 1附屬紅旗醫(yī)院肝病及感染性疾病科 2藥學(xué)院 3附屬紅旗醫(yī)院臨床藥學(xué)部，黑龍江牡丹江157011

肝細(xì)胞癌簡稱肝癌，是臨床常見的惡性腫瘤類型，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高[1-2]。肝癌的臨床治療目前以手術(shù)切除為主，化療和放療為輔[3]。然而，由于肝癌具有高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率、術(shù)后5年生存率普遍較低的特點(diǎn)[4]，因此尋找有效的抗肝癌藥物具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。

越來越多的研究表明，中醫(yī)藥在肝癌的治療中取得了良好療效[5-6]。隱丹參酮是從中藥丹參中分離出的一種脂溶性二萜醌類化合物，具抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[7]，尤其是其抗腫瘤作用得到學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究顯示，隱丹參酮對(duì)多種腫瘤具有較好的抗腫瘤效果，如：乳腺癌[8]、肺癌[9]、腎細(xì)胞癌[10]、胃癌[11]、膀胱癌[12]、膽管癌[13]和卵巢癌[14]等。Park等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一新型細(xì)胞死亡方式，與壞死、自噬、凋亡等死亡方式不同，其不消耗能量，不發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣超載，沒有凋亡標(biāo)志物[16]，僅以細(xì)胞內(nèi)超載的游離鐵催化具有高反應(yīng)破壞性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞膜斷裂、線粒體嵴減少或消失、溶酶體或DNA等損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡[17-18]。本研究觀察了隱丹參酮在人肝癌HepG2細(xì)胞鐵死亡中的作用。

材料和方法

材料和試劑人肝癌HepG2細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫，HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，在含有10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隱丹參酮(純度>98.0 %)購自中國藥品生物制品檢定所，DMEM培養(yǎng)基購自美國Life Technology 公司，胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒、DCFH-DA探針、谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，鐵死亡抑制劑Ferrostain-1(Fer-1)、鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine，DFO)、ROS清除劑乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，兔抗人胱氨酸谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)體輕鏈蛋白(cystine/glutamate antiporter system light chain，xCT)單克隆抗體、兔抗人谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)單克隆抗體購自英國Abcam 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG購自美國Cell signaling Technology公司。

CCK-8法檢測HepG2細(xì)胞活力將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以0.25% 胰蛋白酶消化，調(diào)整至2×104個(gè)/ml密度接種于96孔板中，每孔100 μl；置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度隱丹參酮(0、20、40、60、80、100 μmol/L)，或以1 μmol/L鐵死亡抑制劑Fer-1、5 μmol/L 鐵螯合劑DFO或5 μmol/L ROS清除劑NAC預(yù)處理12 h，37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入10 μl CCK-8 溶液繼續(xù)孵育4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm 處檢測各孔的光密度(optical density，OD)值，同時(shí)設(shè)置空白培養(yǎng)基作為對(duì)照檢測細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白對(duì)照組)/(OD0 μmol/L隱丹參酮-OD空白對(duì)照組)×100 %。每組設(shè)6個(gè)平行孔，取平均值，計(jì)算隱丹參酮對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)。

倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以0.25% 胰蛋白酶消化，調(diào)整至2×104個(gè)/ml密度接種于6孔板，置于37 ℃、5 % CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度隱丹參酮(0、40、60、80 μmol/L)，37 ℃、5 % CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用倒置相差顯微鏡(×400)觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并拍照，每組設(shè)3個(gè)平行孔。

DCFH-DA探針檢測HepG2細(xì)胞ROS水平將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以0.25 % 胰蛋白酶消化，調(diào)整至2×104個(gè)/ml密度接種于6孔板，置于37 ℃、5 % CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度隱丹參酮(0、40、60、80 μmol/L)或以1 μmol/L Fer-1預(yù)處理12 h，37 ℃、5 % CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入1 ml 2 μmol/L DCFH-DA繼續(xù)孵育30 min，上機(jī)流式細(xì)胞術(shù)檢測分析熒光強(qiáng)度。結(jié)果以相對(duì)0 μmol/L 組的倍數(shù)表示，每組設(shè)3個(gè)平行孔，取平均值。

GSH水平檢測細(xì)胞培養(yǎng)及分組同“DCFH-DA探針檢測HepG2細(xì)胞ROS水平”。嚴(yán)格參照GSH 測定試劑盒說明書檢測GSH 水平，結(jié)果以相對(duì)0 μmol/L 組的倍數(shù)表示，每組設(shè)3個(gè)平行孔，取平均值。

Western blot法檢測xCT和GPX4表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同“DCFH-DA探針檢測HepG2細(xì)胞ROS水平”。收集細(xì)胞并用PBS洗滌2 次，以RIPA 細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行裂解，提取總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白變性，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉液室溫封閉2 h，TBST 洗膜后，一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行計(jì)值及統(tǒng)計(jì)分析。以內(nèi)參蛋白GAPDH 為參照，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)3個(gè)平行孔，取平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)的比較采用t-檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，多組間差異的兩兩比較采用Bonferroni校正，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

隱丹參酮可抑制HepG2細(xì)胞活力CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隱丹參酮0、40、60、80、100 μmol/L組的HepG2細(xì)胞活力分別為(100.00±0.00)%、(93.28±12.01)%、(80.89±10.36)%、(73.26±9.38)%、(54.70±7.00)%、(41.23±5.27)%，其中，40(t=2.112，P=0.048)、60(t=3.209，P=0.006)、80(t=6.414，P=0.003)、100 μmol/L組(t=11.054，P<0.001)的細(xì)胞活力均明顯低于0 μmol/L組，20 μmol/L組與0 μmol/L組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.490，P=0.649)。隱丹參酮IC50為93.73 μmol/L。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取40、60、80 μmol/L 隱丹參酮進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

隱丹參酮對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響倒置光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，隱丹參酮0 μmol/L組細(xì)胞形態(tài)大小正常，聚集成團(tuán)樣，生長良好；隱丹參酮40、60、80 μmol/L組細(xì)胞生長狀態(tài)差，形態(tài)不規(guī)則并呈離散狀生長，數(shù)目減少，細(xì)胞變小，細(xì)胞攣縮，黏附力差，可見漂浮的細(xì)胞或碎片(圖1)。

隱丹參酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS水平累積流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隱丹參酮0、40、60、80 μmol/L組的HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別為1.00±0.00、1.71±0.22、1.98±0.25、2.11±0.27，其中，隱丹參酮40(t=3.279，P=0.031)、60(t=4.195，P=0.004)、80 μmol/L組(t=4.460，P=0.003)的HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯高于0 μmol/L組。

隱丹參酮降低HepG2細(xì)胞GSH水平GSH檢測結(jié)果顯示，隱丹參酮0、40、60、80 μmol/L組的HepG2細(xì)胞相對(duì)GSH水平分別為1.00±0.00、0.81±0.10、0.62±0.07、0.43±0.05，其中，隱丹參酮40(t=2.083，P=0.041)、60(t=4.691，P=0.009)、80 μmol/L組(t=10.182，P<0.001)的HepG2細(xì)胞相對(duì)GSH水平明顯低于0 μmol/L組。

隱丹參酮下調(diào)HepG2細(xì)胞xCT和GPX4表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示，隱丹參酮0、40、60、80 μmol/L組HepG2細(xì)胞的相對(duì)xCT和GPX4水平分別為1.00±0.00和1.00±0.00、0.71±0.09和0.68±0.08、0.44±0.05和0.22±0.02、0.18±0.02和0.10±0.01，其中，40(t=3.126，P=0.035；t=3.625，P=0.023)、60(t=9.575，P<0.001；t=11.867，P<0.001)、80 μmol/L組(t=14.383，P<0.001；t=16.539，P<0.001)HepG2細(xì)胞的相對(duì)xCT和GPX4水平明顯低于0 μmol/L組(圖2)。

A.0 μmol/L；B.40 μmol/L；C.60 μmol/L；D.80 μmol/L圖1 倒置光學(xué)顯微鏡下觀察不同濃度隱丹參酮處理對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)Fig 1 Morphological changes of HepG2 cells treated with different levels of cryptotanshinone under an inverted optical microscope(×400)

圖2 Western blot檢測隱丹參酮對(duì)HepG2細(xì)胞xCT和GPX4表達(dá)的影響Fig 2 Western blot for the expression of xCT and GPX4 in HepG2 cells treated with cryptotanshinone

不同抑制劑可恢復(fù)HepG2細(xì)胞活力分別采用鐵死亡抑制劑Fer-1、鐵螯合劑DFO、ROS清除劑NAC處理HepG2細(xì)胞，觀察相同隱丹參酮處理?xiàng)l件下不同抑制劑對(duì)隱丹參酮引起的細(xì)胞活力下降的恢復(fù)作用，結(jié)果顯示，隱丹參酮+Fer-1組、隱丹參酮+DFO組和隱丹參酮+NAC組的HepG2細(xì)胞活力分別為(82.35±10.54)%(t=6.414，P=0.003)、(76.25±9.76)%(t=4.535，P=0.011)和(63.03±8.07)% (t=2.590，P=0.036)，均明顯高于隱丹參酮80 μmol/L組的(54.70±7.00)%。

鐵死亡抑制劑Fer-1可恢復(fù)隱丹參酮誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞變化基于Fer-1對(duì)HepG2細(xì)胞活性恢復(fù)作用更明顯，選取Fer-1進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，隱丹參酮+Fer-1組的HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度為1.34±0.17，明顯低于隱丹參酮80 μmol/L組的2.11±0.27(t=3.244，P=0.014)。隱丹參酮+Fer-1組的相對(duì)GSH水平為0.80±0.10，明顯高于隱丹參酮80 μmol/L組的0.43±0.05(t=3.169，P=0.033)。Western blot檢測結(jié)果顯示，隱丹參酮+Fer-1組的相對(duì)xCT和GPX4水平分別為0.98±0.12和0.91±0.11，明顯高于隱丹參酮80 μmol/L組的0.27±0.03(t=5.430，P=0.006)和0.14±0.01(t=6.517，P=0.003)(圖3)。

圖3 Western blot檢測Fer-1對(duì)HepG2細(xì)胞xCT、GPX4表達(dá)的影響Fig 3 Western blot for the expression of xCT and GPX4 in HepG2 cells treated with Fer-1

討 論

細(xì)胞增殖失控為腫瘤細(xì)胞重要的生物學(xué)特性[19]。本研究結(jié)果顯示，隱丹參酮作用于HepG2細(xì)胞后，可顯著抑制細(xì)胞活力，在隱丹參酮作用下，HepG2細(xì)胞發(fā)生攣縮，并出現(xiàn)細(xì)胞死亡，與Park等[15]報(bào)道結(jié)果一致。此外本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可使HepG2細(xì)胞ROS累積增加，提示其可能具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞鐵死亡的作用。

GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑。xCT為胱氨酸-谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體的輕鏈亞基，負(fù)責(zé)將胱氨酸從細(xì)胞外運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)還原為半胱氨酸，參與GSH的合成[20-21]。GPX4是一種硒代半胱氨酸酶，其高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖受損，血管生成減少[22]。GSH可在GPX4的作用下還原ROS和活性氮[23]。研究表明，抑制xCT會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化損傷體系中GSH耗竭，進(jìn)而抑制GPX-4活性，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)定性及ROS累積，成為鐵死亡的標(biāo)志[24]。本研究結(jié)果顯示，隱丹參酮可顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞xCT表達(dá)，降低GSH水平，亦下調(diào)GPX4表達(dá)，并誘導(dǎo)ROS累積。

鐵死亡不能被自噬抑制劑、凋亡抑制劑所抑制，卻可以被鐵死亡抑制劑、鐵螯合劑、ROS清除劑等所抑制，因此鐵死亡是鐵依賴性的[25-26]。本研究將隱丹參酮與鐵死亡抑制劑Fer-1、鐵螯合劑DFO、ROS清除劑NAC聯(lián)合處理HepG2細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同鐵死亡抑制劑分子對(duì)隱丹參酮誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞細(xì)胞活力下降均有恢復(fù)作用，以Fer-1恢復(fù)作用最為明顯，提示鐵死亡在隱丹參酮誘導(dǎo)的死亡方式中占有主要地位。本研究還檢測了Fer-1對(duì)隱丹參酮誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞ROS累積，GSH水平及xCT和GPX4表達(dá)的恢復(fù)情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)er-1能夠抑制隱丹參酮誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞ROS累積，并能夠使隱丹參酮導(dǎo)致的GSH水平降低及下調(diào)的xCT、GPX4表達(dá)得到恢復(fù)。以上結(jié)果進(jìn)一步提示了隱丹參酮可能具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞鐵死亡的作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示，隱丹參酮可能通過抑制GPX4和xCT表達(dá)使HepG2細(xì)胞中ROS累積，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，這可能是隱丹參酮抗肝癌的作用機(jī)制之一。