超聲造影參數(shù)在糖尿病腎病K-W結(jié)節(jié)形成中的評估價值

王一茹，李 楠，趙 萍，林 林，田曉琦，董哲毅，劉嬌娜，王 倩，李秋洋，唐 杰，羅渝昆

中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 1超聲診斷科 2腎臟病學(xué)部，北京 100853

糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，隨著我國人口老齡化與生活方式的變化，DM患病率從1980 年的0.67%迅速增長至2013年的10.40%[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已成為我國尿毒癥的第2位原發(fā)疾病，僅次于原發(fā)性腎小球疾病[2]。DN早期癥狀隱匿，病程進展快、不可逆，治療較為困難，易進展為慢性腎功能不全。K-W結(jié)節(jié)是DN的特征性病理改變之一，病理表現(xiàn)為腎小球系膜基質(zhì)重度增生，形成結(jié)節(jié)狀硬化，該結(jié)節(jié)在過碘酸六胺銀(periodic acid-silver metheramine，PASM)染色下呈同心圓狀排列。研究認為，微血管損傷是K-W結(jié)節(jié)形成的重要因素[3-5]。Tervaert等[6]研究認為，K-W結(jié)節(jié)是DN預(yù)后的重要指標，其形成往往預(yù)示著腎小球病理分期進入Ⅲ期。本課題組前期研究顯示，超聲造影(contrast enhanced ultrasound，CEUS)能夠評估DN腎臟微血流灌注[7]。DN患者中，K-W結(jié)節(jié)形成與否其微血流灌注如何變化尚不明確。本研究探討了CEUS能否對K-W結(jié)節(jié)的形成提供無創(chuàng)評估參數(shù)，以期為進一步闡述DN進展中血流微灌注提供依據(jù)。

對象和方法

對象及分組2017年3月至2020年1月在中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心超聲診斷科行CEUS檢查且行腎臟穿刺活檢、病理診斷為DN的患者62例，根據(jù)有無K-W結(jié)節(jié)形成分為無K-W結(jié)節(jié)組(n=19)和有K-W結(jié)節(jié)組(n=43)。DN腎臟病理診斷參照2010年腎臟病理學(xué)會研究委員會標準[6]。納入標準：(1)年齡>18歲；(2)臨床確診為2型DM；(3)出現(xiàn)微量白蛋白尿(尿白蛋白肌酐比30～300 mg/g)或大量白蛋白尿(尿白蛋白肌酐比≥300 mg/g)或腎小球濾過率估計值(estimated glomerular filtration rate，eGFR)下降[<60 ml·min-1·(1.73 m2)-1]；(4)腎臟病理診斷明確為DN。排除標準：(1)病例資料不全(如無DM病史等)；(2)合并泌尿系感染；(3)合并其他急性感染性疾病(如呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等感染)；(4)合并系統(tǒng)性疾病(如過敏性紫癜混合型、系統(tǒng)性血管炎、Goodpasture綜合征等)；(5)病理診斷為DN合并非糖尿病腎病患者；(6)合并惡性腫瘤。本研究經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書(S2017-152-02)。

數(shù)據(jù)收集收集患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)、血壓、DM病史、DM視網(wǎng)膜病變、有無鏡下血尿等；實驗室檢查指標：24 h尿蛋白、eGFR、血漿尿素氮、血肌酐、血糖、總膽固醇、三酰甘油、胱抑素C等。

CEUS采用Siemens S2000超聲診斷儀(德國西門子公司)，探頭為C6-2，頻率為2～6 MHz。顯示左腎長軸切面。超聲造影劑以六氟化硫凍干粉劑(意大利Bracco公司)與生理鹽水5 ml溶液配制成微泡混懸液，震蕩搖勻。經(jīng)肘靜脈團注0.5 ml造影劑，后團注5 ml生理鹽水。造影劑達到腎門處囑患者屏氣，后緩慢平穩(wěn)呼吸。圖像采集由2名高年資超聲醫(yī)師(具有5年以上腎臟超聲評估經(jīng)驗及3年以上CEUS評估經(jīng)驗)完成。

CEUS圖像分析圖像分析采用Vuebox 7.0軟件(德國博萊科公司)。在左腎中部至下部距包膜1 cm內(nèi)放置腎皮質(zhì)感興趣區(qū)(region of interest，ROI)1，在鄰近皮質(zhì)的髓質(zhì)區(qū)放置感興趣區(qū)(ROI2)，盡量避開弓狀動脈，ROI面積為0.3 cm2。每次測量重復(fù)3次，取平均值。開啟運動補償條件，自動獲得時間-強度曲線(time intensity curve，TIC)及造影參數(shù)。參數(shù)包括：峰值強度(peak enhancement，PE)、流入相曲線下面積(wash-in area under the curve，WiAUC)、上升時間(rise time，RT)、局部平均渡越時間(mean transit time，mTT)、達峰時間(time to peak，TTP)、流入相比率(最大斜率)(wash-in rate，WiR)、流入相灌注指數(shù)(wash-in perfusion index，WiPI)、流出相曲線下面積(wash-out AUC，WoAUC)、流入相和流出相曲線下面積(wash-in and wash-out area under curve，WiWoAUC)、下降時間(fall time，F(xiàn)T)和流出相比率(wash-out rate，WoR)。

組織病理學(xué)檢查超聲引導(dǎo)下行左腎穿刺活檢，活檢位置選取左腎下極，由腎臟科醫(yī)生完成。每例樣本采用HE染色、Masson染色，行光鏡檢查。腎臟病理讀片由至少2位腎臟病理學(xué)醫(yī)師進行判讀。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采Mann-WhitneyU檢驗；分類變量用率或比表示，組間比較采用卡方檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組間一般資料比較無K-W結(jié)節(jié)組和K-W結(jié)節(jié)組患者在年齡(t=4.473，P=0.039)和總膽固醇(t=5.747，P=0.023)方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余各項臨床指標間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。無K-W結(jié)節(jié)組患者的典型病例超聲及病理圖像見圖1，K-W結(jié)節(jié)組患者的典型病例超聲及病理圖像見圖2。

表1 兩組患者一般資料的比較Table 1 Comparison of general data between two groups

兩組間CEUS參數(shù)的比較皮質(zhì)CEUS參數(shù)中，K-W結(jié)節(jié)組的時間相關(guān)參數(shù)中位RT和FT分別為6.87 s和20.74 s，明顯長于無K-W結(jié)節(jié)組的5.30 s(U=209，P=0.013)和11.40 s(U=197，P=0.007)；血流灌注相關(guān)參數(shù)中位WiR和WoR分別為820 a.u和250 a.u，明顯小于無K-W結(jié)節(jié)組的1506 a.u(U=228，P=0.031)和617 a.u(U=229，P=0.032)(表2)。

表2 兩組皮質(zhì)CEUS參數(shù)的比較[M(Q1，Q3)]Table 2 Comparison of cortical CEUS parameters between two groups[M(Q1，Q3)]

皮質(zhì)與髓質(zhì)CEUS參數(shù)比值中，K-W結(jié)節(jié)組的中位PE1/PE2、WiR1/WiR2和WoR1/WoR2分別為1.56、2.30和2.81，明顯小于無K-W結(jié)節(jié)組的2.26(U=224，P=0.026)、3.44(U=235，P=0.041)和7.15(U=230，P=0.043)；中位FT1/FT2為0.63，明顯大于無K-W結(jié)節(jié)組的0.29(U=227，P=0.038)(表3)。

表3 兩組皮髓質(zhì)超聲造影參數(shù)比值的比較[M(Q1，Q3)]Table 3 Comparison of ratios of cortical to medullary CEUS parameters between two groups[M(Q1，Q3)]

CEUS：超聲造影；TIC：時間強度曲線；ROI：感興趣區(qū)CEUS：contrast-enhanced ultrasound；TIC：time-intensity curve；ROI：region of interestA.左腎CEUS圖像分析(紅圈：皮質(zhì)取樣框；黃圈：髓質(zhì)取樣框)；B.左腎CEUS TIC曲線；C.腎臟穿刺活檢病理結(jié)果，腎小球系膜增生，未見K-W結(jié)節(jié)形成(HE，×200)A.CEUS image of the left kidney(red circle：ROI of cortex；yellow circle：ROI of medulla)；B.CEUS TIC curve of left kidney；C.renal puncture biopsy showed mesangial hyperplasia of glomerulus and absence of K-W nodules(HE，×200)圖1 男，61歲，糖尿病病史15年，體質(zhì)量指數(shù)24.5 kg/m2，24 h尿蛋白2261.8 mg，腎小球濾過率91.58 ml/(min·1.73 m2)，血肌酐79.8 μmol/LFig 1 A 61-year-old male patient with diabetes history of 15 years，body mass index of 24.5 kg/m2，24-h urinary protein of 2261.8 mg，glomerular filtration rate of 91.58 ml/(min·1.73 m2)，and serum creatinine of 79.8 μmol/L

討 論

DN是糖尿病常見并發(fā)癥之一，研究顯示，近30年來其患病風(fēng)險改善不如其他并發(fā)癥，病情難以控制[8]。DN進展至終末期腎病的速度顯著高于其他腎病，嚴重影響患者的預(yù)后。依據(jù)現(xiàn)行腎臟病理學(xué)會提出的DN腎臟病理分型標準[6，9]，根據(jù)腎小球病變程度將DN腎臟病變分為4期，其中K-W結(jié)節(jié)為區(qū)分Ⅱ期和Ⅲ期的關(guān)鍵診斷指標。研究表明，K-W結(jié)節(jié)的形成是提示DN不良預(yù)后的重要指標[10-12]。如果能通過無創(chuàng)影像學(xué)參數(shù)對K-W結(jié)節(jié)形成與否這一病變進展程度進行提示，將對患者的早期診斷及藥物干預(yù)具有重要意義。

CEUS可提供實質(zhì)臟器微循環(huán)血流實時超聲圖像，并通過建立時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)，以相應(yīng)的定量參數(shù)反映造影的動態(tài)過程及強度變化，量化反映組織的灌注特點[13]。超聲造影劑為微氣泡，具有較高安全性和可重復(fù)性，微氣泡經(jīng)過呼吸道代謝，不通過腎臟代謝，不損傷腎功能，是適用于腎臟的增強影像學(xué)方法。Ma等[14]和Dong 等[15]研究顯示，CEUS能夠定量評估早期DN的腎臟血流灌注。Wang等[16]研究認為，AUC可作為糖尿病腎病早期腎損傷和腎微血管高灌注的敏感指標。目前研究觀察的是CEUS參數(shù)與臨床分期或患者臨床特征的參數(shù)，而納入病理學(xué)指標分析CEUS參數(shù)的研究鮮見。本研究則納入了經(jīng)病理組織學(xué)證實的DN患者，以K-W結(jié)節(jié)形成為主要因素，分為K-W結(jié)節(jié)形成組與無K-W結(jié)節(jié)形成組，對其CEUS參數(shù)的改變進行探討。

A.左腎CEUS圖像分析(紅圈：皮質(zhì)取樣框；黃圈：髓質(zhì)取樣框)；B.左腎CEUS TIC曲線；C.腎臟穿刺活檢病理結(jié)果，K-W結(jié)節(jié)(HE，×200)A.CEUS image of the left kidney(red circle：ROI of cortex；yellow circle：ROI of medulla)；B.CEUS TIC curve of the left kidney；C.renal puncture biopsy showed the presence of K-W nodules(HE，×200)圖2 男，68歲，糖尿病病史8年，體質(zhì)量指數(shù)35.6 kg/m2，24 h尿蛋白3977.6 mg，腎小球濾過率26.15 ml/(min·1.73 m2)，血肌酐175.7 μmol/LFig 2 A 68-year-old male patient with diabetes history of 8 years，body mass index of 35.6 kg/m2，24-h urinary protein of 3977.6 mg，glomerular filtration rate 26.15 ml/(min·1.73 m2)，and serum creatinine of 175.7 μmol/L

本研究結(jié)果顯示，K-W結(jié)節(jié)組與無K-W結(jié)節(jié)組間的性別、體質(zhì)量指數(shù)、血壓和糖尿病罹患時間等無顯著差異；K-W結(jié)節(jié)組患者發(fā)病年齡偏小，提示DN發(fā)病年齡越小，病程進展可能越快。因此，對于DN患者早期識別具有重要意義。此外本研究還顯示，K-W結(jié)節(jié)組腎小球濾過率較無K-W結(jié)節(jié)組低，血肌酐、尿蛋白、血糖、三酰甘油和胱抑素C等較無K-W結(jié)節(jié)組高，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。K-W結(jié)節(jié)組糖尿病視網(wǎng)膜病變及出現(xiàn)血尿的人數(shù)比例也較無K-W結(jié)節(jié)組多，但差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。上述參數(shù)雖無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量有限有關(guān)，而這些臨床參數(shù)變化的趨勢提示K-W結(jié)節(jié)組患者病情更重。本研究根據(jù)K-W結(jié)節(jié)出現(xiàn)與否為標準，分析CEUS對腎臟灌注的評估能力，結(jié)果顯示，CEUS結(jié)果在對不同病理分級(Ⅱ期及Ⅲ期以上)病變中部分參數(shù)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，證實CEUS能夠?qū)Σ±矸制冖?Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期DN血流灌注差異進行評估。

K-W結(jié)節(jié)是DN特征性的改變。DN的標志是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的沉積，如腎小球系膜、腎小管間質(zhì)和基底膜中的膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白[17]。ECM的表達增加導(dǎo)致腎小球和腎小管基底膜增厚和系膜基質(zhì)增加，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。特征性的腎小球系膜病變即被描述為K-W結(jié)節(jié)，有時被稱為糖尿病結(jié)節(jié)性腎小球硬化。Paueksakon等[5]在含有系膜紅細胞碎片的K-W結(jié)節(jié)內(nèi)發(fā)現(xiàn)纖溶酶原激活物抑制劑-1更多，認為K-W結(jié)節(jié)的形成與微血管損傷相關(guān)。有研究認為，K-W結(jié)節(jié)的形成多位于腎小球毛細血管袢的中心區(qū)，擠壓毛細血管腔，其對腎小球毛細血管袢的壓迫導(dǎo)致毛細血管袢血流量下降，從而導(dǎo)致系膜區(qū)異物的蓄積，引起腎小球濾過膜通透性下降[5，18-19]。Conlin等[20]采用核磁技術(shù)評估糖尿病小鼠模型，證實腎小球系膜細胞的ECM增生嚴重減少了腎小球血流量，并認為ECM的擴張不可避免地“擠壓”腎小球內(nèi)的血管空間，粗略估計，在纖維化誘導(dǎo)下腎小球的血管空間下降30%。

CEUS參數(shù)中，血流灌注參數(shù)腎皮質(zhì)PE在K-W結(jié)節(jié)組較無K-W結(jié)節(jié)組低，提示皮質(zhì)局部微血流量低。K-W結(jié)節(jié)組WiR及WiRI較無K-W結(jié)節(jié)組低，且WiR差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示在K-W結(jié)節(jié)組，腎臟皮質(zhì)微泡灌注速度及單位時間內(nèi)灌注流量較無K-W結(jié)節(jié)組低。時間相關(guān)參數(shù)RT、mTT和FT在K-W結(jié)節(jié)組中均較無K-W結(jié)節(jié)組延長。上述這些改變可能是K-W結(jié)節(jié)形成后，其對毛細血管袢壓迫而造成毛細血管袢血流量下降引起；此外，可能與K-W結(jié)節(jié)形成常伴隨形成微小血管瘤，造成造影劑的流入及流出均有所延遲有關(guān)。本課題組前期研究DN與非糖尿病腎病(non-diabetic renal disease，NDRD)灌注差異中，觀察到PE、曲線下面積等指標DN 組較NDRD組低。研究認為，灌注參數(shù)與臨床CKD分期可能存在一定的相關(guān)性。而在本研究中，針對與病理分期相關(guān)的K-W結(jié)節(jié)形成與否為分組條件，PE未顯示出顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，推測原因為，一方面病理分期與臨床分期并非能夠精準地一一對應(yīng)，另一方面本研究有限的病例數(shù)可能限制了此類數(shù)據(jù)差異的顯現(xiàn)。

以往研究認為，CEUS技術(shù)能夠?qū)δI髓質(zhì)血流灌注進行評估[21-22]。然而，Yang等[23]研究顯示，髓質(zhì)參數(shù)可能會被髓質(zhì)周圍的血管或皮質(zhì)強度影響而不夠準確。本研究在數(shù)據(jù)收集過程中，對患者吸憋氣進行檢查前培訓(xùn)，患者多能達到較為理想的狀態(tài)，即腎臟隨呼吸上下移動平緩。在髓質(zhì)數(shù)據(jù)采集中盡量選取垂直距離接近腎臟皮質(zhì)處的區(qū)域，以最大程度降低髓質(zhì)周圍小血管的影響。但為盡可能減小髓質(zhì)周圍血管及皮質(zhì)的影響，分析中采用皮質(zhì)參數(shù)與髓質(zhì)參數(shù)的比值進行比較。Yi等[24]研究顯示，腎髓質(zhì)只接受總腎血流量10%左右，腎臟雙腎毛細血管系統(tǒng)可以解釋腎皮質(zhì)和髓質(zhì)灌注模式的顯著差異。血液在髓質(zhì)前供應(yīng)到腎皮質(zhì)，腎皮質(zhì)的強化是早期、均勻和較強的；隨后髓質(zhì)逐漸不均勻強化，表現(xiàn)為延遲峰值，且呈稀疏強化。早期皮質(zhì)快速流入反映了血液流入腎小球。延遲峰值可能代表第二毛細血管床的腎小管灌注，同時逐漸流入髓質(zhì)。本研究中，在CEUS血流量和灌注強度參數(shù)方面，K-W結(jié)節(jié)組皮質(zhì)與髓質(zhì)的PE之比，WiR、WiRI和WoR之比均較無K-W結(jié)節(jié)組小，提示皮質(zhì)與髓質(zhì)血流灌注差異在K-W結(jié)節(jié)組更為顯著。而時間相關(guān)參數(shù)皮、髓質(zhì)FT之比則在K-W結(jié)節(jié)組大，造影劑流出延遲。在臨床患者中對髓質(zhì)血流灌注進行研究無疑面臨著較大難度，其中最為顯著的是患者的呼吸運動配合度。在腎臟CEUS參數(shù)分析中，本研究選取了皮質(zhì)顯影均勻、動度小的位置作為感興趣區(qū)。而髓質(zhì)位置比較局限，周圍存在皮質(zhì)甚至細微血管；腎臟會隨呼吸運動上下運動，雖然本研究中受試者已接受了吸憋氣訓(xùn)練，但到中后期，難以避免腎臟的運動；運動過程中，即便使用了CEUS分析軟件中的運動補償條件，也難免存在一些運動補償欠佳的情況，導(dǎo)致感興趣區(qū)在某一幀納入了周圍組織。由此本研究提出采用鄰近皮、髓質(zhì)比值進行分析，而摒棄了直接比較髓質(zhì)參數(shù)，能夠盡可能降低上述混雜因素對造影參數(shù)帶來的影響。由此本研究認為，皮質(zhì)與髓質(zhì)比值可能較髓質(zhì)相關(guān)參數(shù)更為穩(wěn)定、客觀。

本研究以病理診斷為基礎(chǔ)，探討了CEUS參數(shù)評估DN進展程度的意義。但存在以下局限性：(1)研究聚焦DN 的K-W結(jié)節(jié)，目前僅局限在K-W結(jié)節(jié)的定性診斷即有無結(jié)節(jié)形成，但對于K-W結(jié)節(jié)的數(shù)目未能進行評估。(2)納入樣本量有限，且為單中心研究。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEUS對DN的進展程度可能具有提示意義，對DN患者K-W結(jié)節(jié)形成與否的腎臟皮髓質(zhì)微血流灌注能夠提供定量評估參數(shù)。在K-W結(jié)節(jié)組，RT、LT延長，WiR、WoR下降。