許紅喜,劉勝軍,張 震,劉國君
(1.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,哈爾濱 150038;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),黑龍江 大慶 163319;3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所,哈爾濱 150086)
隨著全國范圍內(nèi)鵝業(yè)的大發(fā)展,黑龍江省先后引入了霍爾多巴吉、四川白鵝、皖西白鵝、獅頭鵝、浙東白鵝及大三花等知名鵝品種加以利用,這為黑龍江省發(fā)展鵝業(yè)生產(chǎn)提供了充足的種源保障[1]。黑龍江省本土看家品種籽鵝適應(yīng)性強(qiáng),產(chǎn)蛋性能高,能在寒冷的氣候環(huán)境、粗劣的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下保持高產(chǎn),是世界上罕見的高產(chǎn)鵝種[2]。但是與引進(jìn)的快大型肉鵝相比體型小、生長速度慢,有逐漸被廣大養(yǎng)殖戶淘汰的趨勢(shì)[3],保種育種成為當(dāng)前黑龍江省鵝養(yǎng)殖研究中的重點(diǎn)[4]。鵝精液冷凍技術(shù)是一種有效的保種方法,使人工輸精技術(shù)不再受時(shí)間和空間的限制,對(duì)促進(jìn)鵝精液采集和人工輸精技術(shù)的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。家禽精液冷凍技術(shù)正致力于瀕危禽類精子冷凍保存基因庫的建立,在歐洲瀕危物種計(jì)劃(EEP)中冷凍保存了17種瀕危雞形目的精液[5]。鵝精液采集和冷藏冷凍技術(shù),特別是精液冷凍后用于人工輸精方面還沒有真正應(yīng)用于生產(chǎn)。鵝與雞、鴨等其他家禽相比個(gè)體大、飼養(yǎng)成本高,自然交配公母比率低(1∶4左右),精液品質(zhì)、產(chǎn)蛋、受精率和孵化率都較低,尤其到了繁殖后期精液品質(zhì)、交配頻率和受精率又急劇降低,因此,在產(chǎn)蛋不同時(shí)期進(jìn)行種鵝精液篩查的同時(shí)研究冷凍技術(shù)是非常必要的。如果禽精液冷凍技術(shù)能成熟應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中,對(duì)引種保種、改良本地品種、節(jié)約成本、增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益意義重大。本研究進(jìn)行了哈爾濱地區(qū)4—6月份自然狀況下籽鵝精子品質(zhì)、冷藏和冷凍后精子活力測(cè)定,為后續(xù)進(jìn)行籽鵝人工授精奠定基礎(chǔ),現(xiàn)報(bào)道如下。
2018年4月1日,在哈爾濱牧娃鵝業(yè)種鵝場,選取健壯活潑、陰莖發(fā)育良好的2歲純種籽鵝種公鵝20只,單獨(dú)飼養(yǎng),飼養(yǎng)管理方式與大群種鵝相同。
主要試劑包括L-谷氨酸鈉(G8010,Solarbio?公司產(chǎn)品)、無水磷酸氫二鈉(D7290,Solarbio?公司產(chǎn)品)、無水磷酸二氫鈉(Solarbio?公司產(chǎn)品)、無水葡萄糖(Solarbio?公司產(chǎn)品)、聚乙烯吡咯烷酮(Solarbio?公司產(chǎn)品)、硫酸魚精蛋白(Solarbio?公司產(chǎn)品)、肌醇(Solarbio?公司產(chǎn)品)、二甲基乙酰胺DMA(Solarbio?公司產(chǎn)品)、無水醋酸鎂(Solarbio?公司產(chǎn)品)、無水醋酸鉀(Solarbio?公司產(chǎn)品)、二甲基甲酰胺(DMF,Solarbio?公司產(chǎn)品)、Tris(Sigma公司產(chǎn)品)。
主要儀器包括天子天平(雷磁公司產(chǎn)品)、滲透壓儀(雷磁公司產(chǎn)品)、顯微鏡(奧林巴斯產(chǎn)品);血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、pH計(jì)(雷磁公司產(chǎn)品)、禽專用集精杯、0.25 mL微型凍精細(xì)管,以上儀器均來源于黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室。
配方1:檸檬酸鉀0.14 g,谷氨酸鈉1.40 g,磷酸氫二鈉0.98 g,磷酸二氫鈉0.21 g,葡萄糖0.70 g,果糖0.20 g,肌醇0.70 g,聚乙烯吡咯烷酮0.10 g,硫酸魚精蛋白0.02 g,水100 mL,滲透壓390 mOsm/kg,pH值7.3[6]。
配方2:谷氨酸鈉1.92 g,葡萄糖0.80 g,無水醋酸鎂0.08 g,無水醋酸鉀0.50 g,聚乙烯吡咯烷酮0.30 g,水100 mL,滲透壓343 mOsm/kg,pH值7.08[7]。
配方3:Tris-檸檬酸稀釋液:三羥甲基氨基甲烷24.224 g,檸檬酸13.536 g,葡萄糖11 g,甘油60 mL,大豆植物蛋白2 g,水1 000 mL[8-9]。
每周進(jìn)行一次采精,在周一早上08:00—09:00,早晨控水控料,采用背腹式按摩采精法[10]采集20只籽鵝精液。背腹式按摩法采精應(yīng)由3人操做。先把鵝放在采精架上,一位助手按住鵝的翅膀根部(也可以把鵝保定),另一位助手左手持集精杯,右手用滅菌生理鹽水浸過的棉球由中央到外周擦洗泄殖腔。采精人員左手五指分開,掌心向下從公鵝翅膀根部向尾部方向有節(jié)奏地按摩,每次1~2 s,持續(xù) 四五次后左手按摩,捎帶擠壓公鵝尾根部,同時(shí)右手拇指和食指有節(jié)奏地按摩腹部后面的柔軟部,并逐漸擠壓按摩泄殖腔環(huán),使其充血引起陰莖勃起,此時(shí)左手拇指和食指輕擠泄殖腔環(huán)背側(cè),精液沿輸精溝從陰莖頂端射出。另一位立即用預(yù)先消毒好的集精杯收集精液、需要注意鵝每次所出精液量很少,必須小心收集,勿流于集精杯外,整個(gè)采精過程需要120 s左右。
選擇優(yōu)良籽鵝的精液,用配方1,2,3稀釋液做1∶1稀釋后分成2份,放到有冰袋的保溫盒中盡快帶到實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室將2份樣品中的1份放到4℃冷藏柜進(jìn)行冷藏試驗(yàn),另1份進(jìn)行冷凍試驗(yàn),每份都設(shè)9個(gè)重復(fù)樣品,間隔24 h觀察精子活力。
將凍精細(xì)管和冷凍保護(hù)劑DMF提前放到4℃冷藏柜中預(yù)冷,將冷凍試驗(yàn)的精液在4℃冷藏柜中平衡30 min,在標(biāo)有配方1,2的樣品中加入冷凍保護(hù)劑DMF,終濃度為6%,平衡15 min[11]。用注射器裝管,平衡30min,平鋪在液氮面上熏蒸,熏蒸距離液氮面的高度為2 cm,大約-120℃平衡8 min[13],投入液氮中。用鑷子在液氮中取出細(xì)管凍精,40℃水浴1 min,觀察精子活力,間隔24 h觀察,測(cè)定。
采用A.Jerysz等[12]的方法對(duì)按摩法采精性反應(yīng)程度進(jìn)行分類評(píng)分。1型為優(yōu)秀,反應(yīng)快速少于60 s,射精快;2型為良好,反應(yīng)較慢,多于60 s,射精較慢;3型為差,對(duì)按摩有反應(yīng),反應(yīng)速度特別慢,不射精;4型為最差,對(duì)按摩根本沒反應(yīng)。本試驗(yàn)中選取健壯和陰莖發(fā)育良好的種公鵝20只,經(jīng)評(píng)定,全部為1型。用離心管分別收集公鵝精液,備用。在4—6月份期間,每周一采集種鵝精液,測(cè)定精液品質(zhì),包括射精量、精子密度、精子活力。取當(dāng)月4次平均值作為該月數(shù)據(jù)。
鵝精液體積在禽專用集精杯上直接讀取數(shù)據(jù);精子活力在顯微鏡下觀察評(píng)估5個(gè)視野,記錄數(shù)據(jù);精液密度使用3%NaCl溶液將原精稀釋100倍,在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板數(shù)出5個(gè)中格總精子數(shù),多次測(cè)量,取平均數(shù)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件中的ANOVA程序進(jìn)行檢驗(yàn),后進(jìn)行LSD統(tǒng)計(jì)。
采用背腹式按摩法采精需要用禽專用集精杯收集籽鵝精液。結(jié)果可見,精液外觀顏色呈乳白色,無雜質(zhì),射精量、精子密度和精子活力結(jié)果見表1。其中4,5,6月份射精量分別為0.374,0.310,0.229 mL,精子密度為5.600,4.700,4.089億個(gè)/mL,精子活力為0.806,0.743,0.675,隨著時(shí)間的推移,射精量、精子密度、精子活力都在逐漸下降。
表1 4,5,6月份籽鵝精液品質(zhì)測(cè)定結(jié)果
3種配方稀釋的籽鵝精液保存在4℃冷藏,間隔24 h在顯微鏡下觀察、記錄數(shù)據(jù),結(jié)果見表2。其中保存0 h精子活力在3個(gè)配方之間差異不顯著(P>0.05),保存24 h精子活力在3個(gè)配方之間差異顯著(P<0.05),保存48,72 h精子活力在3個(gè)配方之間差異極顯著(P<0.01)??偟膩碚f,隨著時(shí)間的推移,精子活力呈下降趨勢(shì),配方3的精子活力在各時(shí)間點(diǎn)都是最高的。
表2 4℃冷藏籽鵝精液解凍后采用不同稀釋液存放不同時(shí)間的精子活力測(cè)定結(jié)果
3種配方稀釋的籽鵝精液經(jīng)冷凍程序冷凍保存在液氮中,細(xì)管凍精在40℃水浴中1 min,水平放置剪開兩端,倒入0.5mL離心管,放在4℃冷藏保存,間隔24 h觀察精子活力,結(jié)果見表3。其中保存0,24,48 h精子活力在3個(gè)配方之間差異不顯著(P>0.05),保存72 h精子活力在3個(gè)配方之間差異極顯著(P<0.01)??偟膩碚f,隨著時(shí)間的推移,精子活力呈下降趨勢(shì),配方3的精子活力在各時(shí)間點(diǎn)都是最高的。
表3 超低溫冷凍保存籽鵝精液解凍后采用不同稀釋液存放不同時(shí)間的精子活力測(cè)定結(jié)果
籽鵝射精量范圍為0.1~0.8 mL,4,5,6月份射精量平均是0.37,0.31,0.23 mL,精子密度為5.600,4.700,4.089億個(gè)/mL,精子活力為0.806,0.743,0.675。黑龍江省產(chǎn)蛋高峰在4,5月份,在產(chǎn)蛋后期6月份射精量、精子密度和精子活力顯著下降,可通過嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理使種鵝保持良好的繁殖性能。獅頭鵝飼養(yǎng)管理飼料能量水平應(yīng)達(dá)到11.1 MJ/kg,粗蛋白達(dá)14%以上,鈣、磷分別為1.2%和0.6%。公鵝對(duì) 維生素A、維生素D和 維生素E的需要量比母鵝多,飼料中維生素E濃度達(dá)到每噸飼料40~50 g時(shí),可顯著提高受精率[14]。產(chǎn)蛋后期有必要進(jìn)行精液品質(zhì)評(píng)定,淘汰評(píng)定為差和最差的種公鵝,有利于提高種蛋受精、出雛率及種群繁殖力。
配方1,2,3稀釋液冷藏鵝鮮精試驗(yàn)是在種鵝場采精觀察完稀釋,放在冰盒中帶到實(shí)驗(yàn)室,這個(gè)過程經(jīng)歷了大約6 h。在實(shí)驗(yàn)室開始計(jì)時(shí)采用3種配方的稀釋液保存于4℃,結(jié)果表明,0 h精子活力分別為0.797,0.798,0.803;4℃冷藏第3天(即72 h)活力分別為0.085,0.233,0.388。林禎平等[15]將獅頭鵝精液1∶1稀釋后進(jìn)行人工輸精,種蛋受精率最高,為90%。精液需要達(dá)到一定的有效精子數(shù)才能維持較高的種蛋受精率,每次輸入的有效精子數(shù)需在0.19億個(gè)以上效果較好[15]。因此在生產(chǎn)實(shí)踐中,隨著保存時(shí)間的延長精子活力降低,應(yīng)增加輸精體積,保持有效精子數(shù)在0.19億以上。低溫Tris-檸檬酸大豆植物蛋白冷藏稀釋液(配方3)保存精子到第3天,也與配方1,2一樣,精子活力急劇下降。綜合來看,如果是現(xiàn)采現(xiàn)用,3種稀釋液配方都可用,如果是異地輸精選擇配方3效果較好。
超低溫液氮冷凍鵝精子解凍后,配方1,2是國外應(yīng)用廣泛的Lake’s和EK液,凍后0 h精子活力達(dá)0.243和0.297,低于配方3(0.360)。精子在低溫狀態(tài)下細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變,頂體受到損傷,從而出現(xiàn)冷休克。配方3是Tris-檸檬酸稀釋液,含有大豆植物蛋白,在低溫下起到保護(hù)精子作用。這個(gè)配方未采用傳統(tǒng)的卵黃、牛奶等動(dòng)物性保護(hù)劑,傳統(tǒng)稀釋液卵黃、奶粉或鮮奶等冷凍保護(hù)劑在精液冷凍保存中可以起到較好的抗凍作用,這些冷凍保護(hù)劑有效成分是低密度脂蛋白(LDL);但是世界動(dòng)物健康組織(OIE)早在2003年建議,精液處理中應(yīng)該避免使用有生物學(xué)感染風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物源產(chǎn)品[16]。家禽精液冷凍是家禽人工授精和物種基因庫保存的基礎(chǔ),但目前仍然沒有一套系統(tǒng)有效的冷凍方法能夠使家禽冷凍精液達(dá)到較好而穩(wěn)定的受精率[17]。3種稀釋液效果比較,配方3無論冷藏試驗(yàn)還是冷凍試驗(yàn)保存籽鵝精液效果都是最好的。由此,本試驗(yàn)通過借鑒國外及其他家畜精液冷藏、冷凍保存方法技術(shù),初步建立籽鵝精液冷凍程序,為下一步鵝人工輸精改良本地品種打下良好基礎(chǔ)。
籽鵝是黑龍江省看家鵝品種,很多試驗(yàn)表明籽鵝精液品質(zhì)優(yōu)于其他外來品種如萊茵鵝和豁眼鵝等[18-20]。本試驗(yàn)中,射精量、精子密度及精子活力這些指標(biāo)到產(chǎn)蛋后期都顯著降低,需要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,提高種蛋受精率;在冷藏試驗(yàn)和冷凍試驗(yàn)保存籽鵝精液都是配方3最好。該方法的建立為下一步鵝人工輸精改良本地品種打下良好基礎(chǔ)。