籽鵝精子品質(zhì)及不同冷凍稀釋液保存效果測(cè)定

許紅喜，劉勝軍，張 震，劉國(guó)君

（1.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150038；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，哈爾濱 150086）

隨著全國(guó)范圍內(nèi)鵝業(yè)的大發(fā)展，黑龍江省先后引入了霍爾多巴吉、四川白鵝、皖西白鵝、獅頭鵝、浙東白鵝及大三花等知名鵝品種加以利用，這為黑龍江省發(fā)展鵝業(yè)生產(chǎn)提供了充足的種源保障［1］。黑龍江省本土看家品種籽鵝適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)蛋性能高，能在寒冷的氣候環(huán)境、粗劣的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下保持高產(chǎn)，是世界上罕見(jiàn)的高產(chǎn)鵝種［2］。但是與引進(jìn)的快大型肉鵝相比體型小、生長(zhǎng)速度慢，有逐漸被廣大養(yǎng)殖戶淘汰的趨勢(shì)［3］，保種育種成為當(dāng)前黑龍江省鵝養(yǎng)殖研究中的重點(diǎn)［4］。鵝精液冷凍技術(shù)是一種有效的保種方法，使人工輸精技術(shù)不再受時(shí)間和空間的限制，對(duì)促進(jìn)鵝精液采集和人工輸精技術(shù)的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。家禽精液冷凍技術(shù)正致力于瀕危禽類(lèi)精子冷凍保存基因庫(kù)的建立，在歐洲瀕危物種計(jì)劃（EEP）中冷凍保存了17種瀕危雞形目的精液［5］。鵝精液采集和冷藏冷凍技術(shù)，特別是精液冷凍后用于人工輸精方面還沒(méi)有真正應(yīng)用于生產(chǎn)。鵝與雞、鴨等其他家禽相比個(gè)體大、飼養(yǎng)成本高，自然交配公母比率低（1∶4左右），精液品質(zhì)、產(chǎn)蛋、受精率和孵化率都較低，尤其到了繁殖后期精液品質(zhì)、交配頻率和受精率又急劇降低，因此，在產(chǎn)蛋不同時(shí)期進(jìn)行種鵝精液篩查的同時(shí)研究冷凍技術(shù)是非常必要的。如果禽精液冷凍技術(shù)能成熟應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，對(duì)引種保種、改良本地品種、節(jié)約成本、增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益意義重大。本研究進(jìn)行了哈爾濱地區(qū)4—6月份自然狀況下籽鵝精子品質(zhì)、冷藏和冷凍后精子活力測(cè)定，為后續(xù)進(jìn)行籽鵝人工授精奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2018年4月1日，在哈爾濱牧娃鵝業(yè)種鵝場(chǎng)，選取健壯活潑、陰莖發(fā)育良好的2歲純種籽鵝種公鵝20只，單獨(dú)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)管理方式與大群種鵝相同。

1.2 試劑與儀器

主要試劑包括L-谷氨酸鈉（G8010，Solarbio?公司產(chǎn)品）、無(wú)水磷酸氫二鈉（D7290，Solarbio?公司產(chǎn)品）、無(wú)水磷酸二氫鈉（Solarbio?公司產(chǎn)品）、無(wú)水葡萄糖（Solarbio?公司產(chǎn)品）、聚乙烯吡咯烷酮（Solarbio?公司產(chǎn)品）、硫酸魚(yú)精蛋白（Solarbio?公司產(chǎn)品）、肌醇（Solarbio?公司產(chǎn)品）、二甲基乙酰胺DMA（Solarbio?公司產(chǎn)品）、無(wú)水醋酸鎂（Solarbio?公司產(chǎn)品）、無(wú)水醋酸鉀（Solarbio?公司產(chǎn)品）、二甲基甲酰胺（DMF，Solarbio?公司產(chǎn)品）、Tris（Sigma公司產(chǎn)品）。

主要儀器包括天子天平（雷磁公司產(chǎn)品）、滲透壓儀（雷磁公司產(chǎn)品）、顯微鏡（奧林巴斯產(chǎn)品）；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、pH計(jì)（雷磁公司產(chǎn)品）、禽專(zhuān)用集精杯、0.25 mL微型凍精細(xì)管，以上儀器均來(lái)源于黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.3 冷凍稀釋液配方

配方1：檸檬酸鉀0.14 g，谷氨酸鈉1.40 g，磷酸氫二鈉0.98 g，磷酸二氫鈉0.21 g，葡萄糖0.70 g，果糖0.20 g，肌醇0.70 g，聚乙烯吡咯烷酮0.10 g，硫酸魚(yú)精蛋白0.02 g，水100 mL，滲透壓390 mOsm/kg，pH值7.3［6］。

配方2：谷氨酸鈉1.92 g，葡萄糖0.80 g，無(wú)水醋酸鎂0.08 g，無(wú)水醋酸鉀0.50 g，聚乙烯吡咯烷酮0.30 g，水100 mL，滲透壓343 mOsm/kg，pH值7.08［7］。

配方3：Tris-檸檬酸稀釋液：三羥甲基氨基甲烷24.224 g，檸檬酸13.536 g，葡萄糖11 g，甘油60 mL，大豆植物蛋白2 g，水1 000 mL［8-9］。

1.4 籽鵝精液的采集

每周進(jìn)行一次采精，在周一早上08：00—09：00，早晨控水控料，采用背腹式按摩采精法［10］采集20只籽鵝精液。背腹式按摩法采精應(yīng)由3人操做。先把鵝放在采精架上，一位助手按住鵝的翅膀根部（也可以把鵝保定），另一位助手左手持集精杯，右手用滅菌生理鹽水浸過(guò)的棉球由中央到外周擦洗泄殖腔。采精人員左手五指分開(kāi)，掌心向下從公鵝翅膀根部向尾部方向有節(jié)奏地按摩，每次1～2 s，持續(xù) 四五次后左手按摩，捎帶擠壓公鵝尾根部，同時(shí)右手拇指和食指有節(jié)奏地按摩腹部后面的柔軟部，并逐漸擠壓按摩泄殖腔環(huán)，使其充血引起陰莖勃起，此時(shí)左手拇指和食指輕擠泄殖腔環(huán)背側(cè)，精液沿輸精溝從陰莖頂端射出。另一位立即用預(yù)先消毒好的集精杯收集精液、需要注意鵝每次所出精液量很少，必須小心收集，勿流于集精杯外，整個(gè)采精過(guò)程需要120 s左右。

1.5 冷藏試驗(yàn)和冷凍試驗(yàn)

選擇優(yōu)良籽鵝的精液，用配方1，2，3稀釋液做1∶1稀釋后分成2份，放到有冰袋的保溫盒中盡快帶到實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室將2份樣品中的1份放到4℃冷藏柜進(jìn)行冷藏試驗(yàn)，另1份進(jìn)行冷凍試驗(yàn)，每份都設(shè)9個(gè)重復(fù)樣品，間隔24 h觀察精子活力。

將凍精細(xì)管和冷凍保護(hù)劑DMF提前放到4℃冷藏柜中預(yù)冷，將冷凍試驗(yàn)的精液在4℃冷藏柜中平衡30 min，在標(biāo)有配方1，2的樣品中加入冷凍保護(hù)劑DMF，終濃度為6%，平衡15 min［11］。用注射器裝管，平衡30min，平鋪在液氮面上熏蒸，熏蒸距離液氮面的高度為2 cm，大約-120℃平衡8 min［13］，投入液氮中。用鑷子在液氮中取出細(xì)管凍精，40℃水浴1 min，觀察精子活力，間隔24 h觀察，測(cè)定。

1.6 測(cè)定項(xiàng)目

采用A.Jerysz等［12］的方法對(duì)按摩法采精性反應(yīng)程度進(jìn)行分類(lèi)評(píng)分。1型為優(yōu)秀，反應(yīng)快速少于60 s，射精快；2型為良好，反應(yīng)較慢，多于60 s，射精較慢；3型為差，對(duì)按摩有反應(yīng)，反應(yīng)速度特別慢，不射精；4型為最差，對(duì)按摩根本沒(méi)反應(yīng)。本試驗(yàn)中選取健壯和陰莖發(fā)育良好的種公鵝20只，經(jīng)評(píng)定，全部為1型。用離心管分別收集公鵝精液，備用。在4—6月份期間，每周一采集種鵝精液，測(cè)定精液品質(zhì)，包括射精量、精子密度、精子活力。取當(dāng)月4次平均值作為該月數(shù)據(jù)。

鵝精液體積在禽專(zhuān)用集精杯上直接讀取數(shù)據(jù)；精子活力在顯微鏡下觀察評(píng)估5個(gè)視野，記錄數(shù)據(jù)；精液密度使用3%NaCl溶液將原精稀釋100倍，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板數(shù)出5個(gè)中格總精子數(shù)，多次測(cè)量，取平均數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件中的ANOVA程序進(jìn)行檢驗(yàn)，后進(jìn)行LSD統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽鵝不同時(shí)間精液品質(zhì)

采用背腹式按摩法采精需要用禽專(zhuān)用集精杯收集籽鵝精液。結(jié)果可見(jiàn)，精液外觀顏色呈乳白色，無(wú)雜質(zhì)，射精量、精子密度和精子活力結(jié)果見(jiàn)表1。其中4，5，6月份射精量分別為0.374，0.310，0.229 mL，精子密度為5.600，4.700，4.089億個(gè)/mL，精子活力為0.806，0.743，0.675，隨著時(shí)間的推移，射精量、精子密度、精子活力都在逐漸下降。

表1 4，5，6月份籽鵝精液品質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.2 冷藏試驗(yàn)

3種配方稀釋的籽鵝精液保存在4℃冷藏，間隔24 h在顯微鏡下觀察、記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2。其中保存0 h精子活力在3個(gè)配方之間差異不顯著（P＞0.05），保存24 h精子活力在3個(gè)配方之間差異顯著（P＜0.05），保存48，72 h精子活力在3個(gè)配方之間差異極顯著（P＜0.01）。總的來(lái)說(shuō)，隨著時(shí)間的推移，精子活力呈下降趨勢(shì)，配方3的精子活力在各時(shí)間點(diǎn)都是最高的。

表2 4℃冷藏籽鵝精液解凍后采用不同稀釋液存放不同時(shí)間的精子活力測(cè)定結(jié)果

2.3 冷凍試驗(yàn)

3種配方稀釋的籽鵝精液經(jīng)冷凍程序冷凍保存在液氮中，細(xì)管凍精在40℃水浴中1 min，水平放置剪開(kāi)兩端，倒入0.5mL離心管，放在4℃冷藏保存，間隔24 h觀察精子活力，結(jié)果見(jiàn)表3。其中保存0，24，48 h精子活力在3個(gè)配方之間差異不顯著（P＞0.05），保存72 h精子活力在3個(gè)配方之間差異極顯著（P＜0.01）?？偟膩?lái)說(shuō)，隨著時(shí)間的推移，精子活力呈下降趨勢(shì)，配方3的精子活力在各時(shí)間點(diǎn)都是最高的。

表3 超低溫冷凍保存籽鵝精液解凍后采用不同稀釋液存放不同時(shí)間的精子活力測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 籽鵝不同時(shí)間精液品質(zhì)比較

籽鵝射精量范圍為0.1～0.8 mL，4，5，6月份射精量平均是0.37，0.31，0.23 mL，精子密度為5.600，4.700，4.089億個(gè)/mL，精子活力為0.806，0.743，0.675。黑龍江省產(chǎn)蛋高峰在4，5月份，在產(chǎn)蛋后期6月份射精量、精子密度和精子活力顯著下降，可通過(guò)嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理使種鵝保持良好的繁殖性能。獅頭鵝飼養(yǎng)管理飼料能量水平應(yīng)達(dá)到11.1 MJ/kg，粗蛋白達(dá)14%以上，鈣、磷分別為1.2%和0.6%。公鵝對(duì) 維生素A、維生素D和 維生素E的需要量比母鵝多，飼料中維生素E濃度達(dá)到每噸飼料40～50 g時(shí)，可顯著提高受精率［14］。產(chǎn)蛋后期有必要進(jìn)行精液品質(zhì)評(píng)定，淘汰評(píng)定為差和最差的種公鵝，有利于提高種蛋受精、出雛率及種群繁殖力。

3.2 關(guān)于冷藏試驗(yàn)

配方1，2，3稀釋液冷藏鵝鮮精試驗(yàn)是在種鵝場(chǎng)采精觀察完稀釋?zhuān)旁诒兄袔У綄?shí)驗(yàn)室，這個(gè)過(guò)程經(jīng)歷了大約6 h。在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始計(jì)時(shí)采用3種配方的稀釋液保存于4℃，結(jié)果表明，0 h精子活力分別為0.797，0.798，0.803；4℃冷藏第3天（即72 h）活力分別為0.085，0.233，0.388。林禎平等［15］將獅頭鵝精液1∶1稀釋后進(jìn)行人工輸精，種蛋受精率最高，為90%。精液需要達(dá)到一定的有效精子數(shù)才能維持較高的種蛋受精率，每次輸入的有效精子數(shù)需在0.19億個(gè)以上效果較好［15］。因此在生產(chǎn)實(shí)踐中，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)精子活力降低，應(yīng)增加輸精體積，保持有效精子數(shù)在0.19億以上。低溫Tris-檸檬酸大豆植物蛋白冷藏稀釋液（配方3）保存精子到第3天，也與配方1，2一樣，精子活力急劇下降。綜合來(lái)看，如果是現(xiàn)采現(xiàn)用，3種稀釋液配方都可用，如果是異地輸精選擇配方3效果較好。

3.3 關(guān)于冷凍試驗(yàn)

超低溫液氮冷凍鵝精子解凍后，配方1，2是國(guó)外應(yīng)用廣泛的Lake’s和EK液，凍后0 h精子活力達(dá)0.243和0.297，低于配方3（0.360）。精子在低溫狀態(tài)下細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，頂體受到損傷，從而出現(xiàn)冷休克。配方3是Tris-檸檬酸稀釋液，含有大豆植物蛋白，在低溫下起到保護(hù)精子作用。這個(gè)配方未采用傳統(tǒng)的卵黃、牛奶等動(dòng)物性保護(hù)劑，傳統(tǒng)稀釋液卵黃、奶粉或鮮奶等冷凍保護(hù)劑在精液冷凍保存中可以起到較好的抗凍作用，這些冷凍保護(hù)劑有效成分是低密度脂蛋白（LDL）；但是世界動(dòng)物健康組織（OIE）早在2003年建議，精液處理中應(yīng)該避免使用有生物學(xué)感染風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物源產(chǎn)品［16］。家禽精液冷凍是家禽人工授精和物種基因庫(kù)保存的基礎(chǔ)，但目前仍然沒(méi)有一套系統(tǒng)有效的冷凍方法能夠使家禽冷凍精液達(dá)到較好而穩(wěn)定的受精率［17］。3種稀釋液效果比較，配方3無(wú)論冷藏試驗(yàn)還是冷凍試驗(yàn)保存籽鵝精液效果都是最好的。由此，本試驗(yàn)通過(guò)借鑒國(guó)外及其他家畜精液冷藏、冷凍保存方法技術(shù)，初步建立籽鵝精液冷凍程序，為下一步鵝人工輸精改良本地品種打下良好基礎(chǔ)。

4 結(jié)語(yǔ)

籽鵝是黑龍江省看家鵝品種，很多試驗(yàn)表明籽鵝精液品質(zhì)優(yōu)于其他外來(lái)品種如萊茵鵝和豁眼鵝等［18-20］。本試驗(yàn)中，射精量、精子密度及精子活力這些指標(biāo)到產(chǎn)蛋后期都顯著降低，需要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高種蛋受精率；在冷藏試驗(yàn)和冷凍試驗(yàn)保存籽鵝精液都是配方3最好。該方法的建立為下一步鵝人工輸精改良本地品種打下良好基礎(chǔ)。