梅花鹿CDKN2C基因cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析

李金躍，劉嫣然，趙晨曦，于夢佳，劉泳彤，黃雨馨，夏彥玲

（東北林業(yè)大學(xué) 野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040）

CDKN2C基因又被稱INK4C基因或P18基因［1］，屬于INK4家族，INK4家族共包括4個成員，按分子質(zhì)量大小及發(fā)現(xiàn)順序依次命名為P16INK4A、P15INK4B、P18INK4C和 P19INK4D［2］。由 于INK4家族各成員的功能單位均由4～5個錨蛋白重復(fù)序列構(gòu)成，具有共同的生物學(xué)特性，即都可以通過與CDK4/6結(jié)合，使cyclinD-CDK4/6復(fù)合物激酶的活性被抑制，從而起到控制細(xì)胞周期G1進(jìn)程的作用［3］。以磷酸化和去磷酸化為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)源性調(diào)控就是在cyclin-CDK -CKI途徑中實現(xiàn)的，在cyclin-CDK-CKI途徑中，cyclin和CKI可對CDK進(jìn)行正調(diào)控或反調(diào)控，在這種調(diào)控機(jī)制正常時保持動態(tài)平衡的狀態(tài)，若這種動態(tài)平衡的正負(fù)調(diào)控機(jī)制一旦不再平衡，細(xì)胞就可能會有增殖異常的情況出現(xiàn)［4］。CDKN2C在正常細(xì)胞周期中發(fā)揮抑癌基因的作用，特異性抑制Cyclins和CDKs的磷酸化活性，從而通過一系列途徑來抑制細(xì)胞癌變，有CDKN2C基因敲除的相關(guān)試驗研究表明，該基因在抑制腫瘤發(fā)生中起到重要作用［5］。

鹿茸的生長發(fā)育速度十分迅速，其頂部組織最快生長時期的分裂速度遠(yuǎn)超惡性腫瘤細(xì)胞，但在快速生長期仍然能保持有序的組織結(jié)構(gòu)而不發(fā)生癌變，這種生物學(xué)現(xiàn)象是當(dāng)今研究的熱門。其分子機(jī)制尚不明確，因此在生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家們致力于研究鹿茸的生長發(fā)育機(jī)制，并且找尋其與細(xì)胞癌變機(jī)制的關(guān)聯(lián)，試圖由此解決癌癥的相關(guān)問題。細(xì)胞周期阻滯可以保護(hù)損傷細(xì)胞，它有利于損傷后DNA的修復(fù)，從而減少損傷導(dǎo)致的致死性和致畸性。CDKN2C基因可以調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)行，這與腫瘤細(xì)胞的增殖等具有密切的聯(lián)系。本試驗以鹿茸組織cDNA 為模板，對鹿茸的CDKN2C基因進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化、測序及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測，以期為今后鹿茸生長發(fā)育機(jī)制及CDKN2C基因在鹿茸生長發(fā)育中所發(fā)揮的重要功能研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

健康成年二杠型東北梅花鹿鹿茸，來自內(nèi)蒙古根河林業(yè)局，采樣時間為2020年2月份，由東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院實驗室保存。在無菌環(huán)境下迅速采集鹿茸約5 cm的頂端組織為試驗樣品，迅速對其表面進(jìn)行消毒，垂直鹿茸生長軸方向切斷，置于液氮中保存，以備后續(xù)使用。

1.2 主要儀器

見表1。

表1 主要儀器

1.3 主要試劑的配制

50×TAE：稱取Tris-Base 242 g置于燒杯中，加入冰乙酸57.1 mL、0.5 mol/L EDTA（pH值8.0）100 mL，加入去離子水定容至1 000 mL，于4℃條件下保存。

氨芐青霉素（100 mg/mL）：用超純水將氨芐青霉素配制成100 mg/mL存儲液，使用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成每管1 mL體積，于-20℃條件下保存。

卡那霉素（50 mg/mL）：用超純水將卡那霉素配制成50 mg/mL存儲液，使用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成每管1 mL體積，于-20℃條件下保存。

X-gal：將粉狀X-gal溶解到二甲基酰胺溶液（DMF）中，制成20 mg/mL溶液，分裝成每管100μL體積，每管外包有鋁箔紙保持遮光，于-20℃條件下保存。

IPTG：稱取2.0 g粉狀I(lǐng)PTG，用無菌去離子水將其定容至10 mL，使用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成每管50μL體積，于-20℃條件下保存。

10 mmol/L NaOH：稱取4.0 g粉狀NaOH，用無菌去離子將其定容至10 mL，于4℃條件下保存。

LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.0 g，NaCl 2.0 g，用去離子水將其定容至100 mL，用10 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4～7.6之間，進(jìn)行高壓滅菌，于4℃條件下保存。

LB固體培養(yǎng)基：先配置100 mL LB液體培養(yǎng)基，再加入1.5 mg瓊脂粉，進(jìn)行高溫滅菌，待滅菌后取出，輕輕搖勻，溫度適宜時向培養(yǎng)基中相繼加入IPTG 20μL、X-gal100μL、氨芐青霉素100μL（卡那霉素50μL），充分混勻后鋪板于培養(yǎng)皿中然后封口，于4℃條件下保存。

1.4 RNA的提取和cDNA的合成

采用TRIzol法提取鹿茸組織中的總RNA，提取完成后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA的完整性和質(zhì)量。以RNA為模板、Oligo-dT為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLVⅢ的催化下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA置于-20℃冰箱中保存，備用。

1.5 梅花鹿CDKN2C基因引物的設(shè)計與合成

參照GenBank牛、羊的CDKN2C基因序列，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計同源引物，擴(kuò)增片段包含該基因的CDS區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為536 bp，引物序列為上游引物5′-CAGGACCCTAAAGAATGGC -3′，下游引物5′-GAGCCCTCCCCACATTC-3′。

1.6 梅花鹿CDKN2C基因cDNA的克隆

以1.5中合成的cDNA為模板，通過PCR技術(shù)獲得CDKN2C 基因cDNA 序列。反應(yīng)體系（25.0μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0μL，上下游引物各1.0μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 17.3μL，cDNA 2.0μL。具體反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，變性95℃30 s，退火57.0℃30 s，延伸72℃30 s，共35個循環(huán)，之后再72℃延伸10 min。用移液槍取6μL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。再利用膠回收試劑盒（購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）回收PCR產(chǎn)物。將目的基因片段與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB固體培養(yǎng)基，利用藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定挑選陽性克隆菌落，送至庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.7 梅花鹿CDKN2C基因的生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder預(yù)測并分析梅花鹿CDKN2C基因序列的開放閱讀框，應(yīng)用NCBI中的BLAST程序?qū)Φ玫降腃DKN2C基因編碼序列進(jìn)行同源性比對分析，并根據(jù)序列比對結(jié)果，運用MEGA X軟件采取鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用ProtParam、ProtScale、PSORTⅡPrediction以及SignalP 3.0 Server在線分析軟件對CDKN2C蛋白的一級序列進(jìn)行分析，運用NCBI中的CD-Search在線分析工具預(yù)測CDKN2C蛋白上的保守結(jié)構(gòu)域，用GOR4和SWISS-MODEL在線軟件分別對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，用CBS網(wǎng)站上的NetPhos 3.1 Server在線分析軟件、NetOGlyc 4.0 Server在線分析軟件以及NetNGlyc 1.0 Server在線分析軟件預(yù)測CDKN2C蛋白的磷酸化位點、O-糖基化位點以及N-糖基化位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花鹿CDKN2C基因的克隆

以梅花鹿鹿茸組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果擴(kuò)增出一條536 bp的特異性帶，與預(yù)期片段大小相符，初步認(rèn)定為CDKN2C基因的cDNA序列，見圖1。

圖1 梅花鹿CDKN2C基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 梅花鹿CDKN2C基因的序列分析

將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，確認(rèn)為是梅花鹿CDKN2C基因后，通過ORF Finder序列分析工具進(jìn)行分析，得出該基因的CDS區(qū)全長507 bp，編碼168個氨基酸，具體的編碼序列及對應(yīng)氨基酸序列見圖2。

2.3 梅花鹿CDKN2C基因編碼序列進(jìn)化樹的構(gòu)建

運用MEGA X軟件構(gòu)建的梅花鹿CDKN2C基因編碼序列系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。梅花鹿與牛最先匯為一支，其與大羚羊、野駱駝、牛以及馬的親緣關(guān)系較近，與智人和長臂猿的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 梅花鹿CDKN2C基因編碼序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 梅花鹿CDKN2C蛋白質(zhì)的特性

2.4.1 蛋白質(zhì)一級序列 ProtParam在線分析軟件分析結(jié)果顯示，該CDKN2C蛋白含168個氨基酸殘基，亮氨酸和丙氨酸含量較高。通過ExPASy服務(wù)器ProtScale模塊的Kyte&Doolittle算法在線分析軟件對梅花鹿CDKN2C蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4，顯示梅花鹿CDKN2C蛋白為親水蛋白。采用PSORTⅡPrediction程序分析其亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，梅花鹿CDKN2C蛋白89%位于細(xì)胞質(zhì)，11%位于細(xì)胞核。用SignalP 3.0 Server在線分析軟件預(yù)測梅花鹿CDKN2C蛋白的信號肽，結(jié)果見圖5，顯示SNRPB不具備信號肽。

圖4 梅花鹿CDKN2C蛋白親/疏水性分析

圖5 梅花鹿CDKN2C蛋白的信號肽預(yù)測

2.4.2 結(jié)構(gòu)域預(yù)測 用CD-Search在線分析工具對梅花鹿CDKN2C蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖6，發(fā)現(xiàn)第46～127位氨基酸殘基之間存在Ank_2結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域包括多個β（2）-α（2）基序重復(fù)序列。

圖6 梅花鹿CDKN2C蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.4.3 二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用GOR4在線軟件對梅花鹿CDKN2C基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白α-螺旋占47.62%，延伸鏈占12.50%，自由卷曲占39.88%，見圖7。用SWISS-MODLE在線軟件分別模擬梅花鹿、牛和人的CDKN2C蛋白高級結(jié)構(gòu)，結(jié)果得出三者結(jié)構(gòu)較為相似，但其中梅花鹿的CDKN2C蛋白結(jié)構(gòu)與牛更為相似，見圖8。

圖7 CDKN2C基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

圖8 梅花鹿、牛、人CDKN2C蛋白三級結(jié)構(gòu)比較

2.4.4 蛋白翻譯后位點修飾的預(yù)測 利用Net-Phos 3.1 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server等在線分析軟件對梅花鹿CDKN2C蛋白翻譯后磷酸化位點、O-糖基化位點和N-糖基化位點修飾進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖9，表明梅花鹿CDKN2C蛋白含有2個絲氨酸和3個蘇氨酸磷酸化位點，分別位于氨基酸序列的第23，154位和第88，126，139位，沒有發(fā)現(xiàn)N-糖基化位點以及O-糖基化位點。

圖9 梅花鹿CDKN2C蛋白的磷酸化位點預(yù)測

3 討論

鹿茸角是鹿科動物的第二性征（馴鹿除外），其在快速生長期仍然能保持有序的組織結(jié)構(gòu)而不發(fā)生癌變［6］，所以科學(xué)家們一直致力于探尋鹿茸生長機(jī)制并希望尋找到其與細(xì)胞癌變機(jī)制的相似點，為癌癥的治療提供新的思路。有研究表明CDKN2C基因敲除與癌癥患者總體生存期下降有關(guān)［7］。CDKN2C是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑［8］，這可能與鹿科動物茸角的快速生長機(jī)制相關(guān)。國內(nèi)外對CDKN2C基因的研究少見報道，因此，研究鹿茸頂端組織的CDKN2C基因及其編碼蛋白可為癌癥治療提供新的思路。

本試驗利用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了梅花鹿的CDKN2C基因，獲得的CDKN2C基因CDS區(qū)全長507 bp，編碼168個氨基酸，無信號肽。將梅花鹿鹿茸組織的CDKN2C基因的CDS序列與智人、長臂猿、土豚、家貓、馬、野駱駝、大羚羊、牛以及抹香鯨等幾個物種的序列進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與牛的親緣關(guān)系最近，這與進(jìn)化規(guī)律相符。應(yīng)用PSTORⅡ程序預(yù)測結(jié)果表明，89%分布在細(xì)胞質(zhì)，11%在細(xì)胞核，說明CDKN2C蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)對鹿茸細(xì)胞的生長發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。SignlP程序預(yù)測該蛋白無信號肽，為非分泌性蛋白。預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其α-螺旋占47.62%，延伸鏈占12.50%，自由卷曲占39.88%，預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)梅花鹿的CDKN2C蛋白結(jié)構(gòu)與牛相似，這與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果相呼應(yīng)，符合進(jìn)化規(guī)律。

使用NCBI中Conserved Domain Search程序分析該蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，第46～127位氨基酸為ANK-2結(jié)構(gòu)域。ANK結(jié)構(gòu)域是自然界最常見的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模式之一，來源于真核生物，存在于許多功能多樣的蛋白質(zhì)中。張富軍［9］在文章中就曾表明ANK重復(fù)序列是最常見的保守蛋白結(jié)構(gòu)域之一。在許多功能蛋白中，ANK結(jié)構(gòu)域可以充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相互作用的支架，并在多種細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架完整性、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期調(diào)控、炎癥反應(yīng)等。而且ANK結(jié)構(gòu)域包括多個β（2）-α（2）基序重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)域的這種重復(fù)主要出現(xiàn)在具有多種功能的蛋白質(zhì)中，如轉(zhuǎn)錄啟動子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子等［10］，說明CDKN2C基因可能具有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用，這與腎癌相關(guān)研究結(jié)論一致［11］。

梅花鹿的CDKN2C蛋白翻譯后位點修飾的預(yù)測分析顯示，其氨基酸序列上有含有2個絲氨酸和3個蘇氨酸磷酸化位點。蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍、最重要的翻譯后修飾之一，幾乎參與細(xì)胞所有的生命活動，尤其是基因表達(dá)調(diào)控和信號傳導(dǎo)［12］，磷酸化還對蛋白翻譯和細(xì)胞增殖等方面有推動作用［13］，可能與信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長發(fā)育以及癌癥機(jī)制等有關(guān)。梁積峰等［14］的研究表明，當(dāng)癌細(xì)胞磷酸化水平顯著增加之后，癌細(xì)胞活力顯著降低，癌細(xì)胞凋亡顯著增加。由此可見，CDKN2C基因可能在抑癌方面發(fā)揮重要作用。本試驗成功克隆了梅花鹿CDKN2C基因序列，并對其表達(dá)的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，以期為今后鹿茸的生長發(fā)育機(jī)制的研究，并為CDKN2C基因在鹿茸生長發(fā)育中所扮演的角色功能研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。