潰瘍性結(jié)腸炎患者腸組織FOXP3和miR-664a-3p的表達(dá)關(guān)系及意義

柯樂(lè)斌 周垂楊 高仁賢

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)作為一種炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，主要以結(jié)腸和直腸黏膜的彌漫性發(fā)炎為特征[1]。近年來(lái)UC的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)確定的現(xiàn)代不治之癥之一，因此盡早探究UC的發(fā)病機(jī)制及尋找藥物靶點(diǎn)具有關(guān)鍵意義[2]。叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead/winged helix transcriptionfactor 3, FOXP3)是CD4+CD25+Tregs細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物[3]；多項(xiàng)研究表明CD4+CD25+Tregs細(xì)胞在IBD中發(fā)揮著重要作用[4, 5]。據(jù)報(bào)道，miRNAs在疾病中的異常表達(dá)會(huì)影響疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]。位于RAB3GAP2內(nèi)含子區(qū)的miR-664a-3p在包括胃癌、宮頸癌、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中均表現(xiàn)出異常表達(dá)[7～9]。此外，有研究表明FOXP3在胃癌細(xì)胞中可以與miR-664a-3p啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并激活其表達(dá)，但在UC中并未見(jiàn)其報(bào)道[7]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)UC患者腸組織中FOXP3與miR-664a-3p表達(dá)水平，進(jìn)而分析二者相關(guān)性及醫(yī)學(xué)臨床意義。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2019年4月～2020年4月在溫州市人民醫(yī)院確診的50例UC患者，其中男性29例，女性21例，患者平均年齡43.04±15.72歲，有吸煙史27例。依據(jù)腸鏡下的病變范圍將UC患者分為遠(yuǎn)端結(jié)腸炎34例和廣泛結(jié)腸炎16例，并按照疾病嚴(yán)重程度分為輕度、中度和重度(參照改良的Truelove & Witts評(píng)分)。以筆者醫(yī)院同期收治的50例結(jié)腸息肉患者為對(duì)照組，其中男性30例，女性20例，患者平均年齡40.06 ± 14.52歲。研究對(duì)象納入前排除感染性腹瀉、放射性腸炎、缺血性腸病、腫瘤等疾病，且均對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意。兩組患者平均年齡、性別、吸煙史等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.主要試劑及儀器：TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，SyBR Green Realtime PCR Master Mix(日本Toyobo公司)，Thermal Cyclers for PCR、CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System(美國(guó)Bio-Rad公司)，Reverse Transcription System(美國(guó)Promega公司)。FOXP3、miR-664a-3p引物(上海生工生物工程公司合成)。鼠抗人FOXP3抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(英國(guó)Abcam公司)。

3.結(jié)腸組織中FOXP3 mRNA和miR-664a-3p水平檢測(cè)：將樣本組織充分研磨后，加入TRIzol試劑按照說(shuō)明書(shū)提取組織RNA，通過(guò)DEPC水稀釋RNA，在分光光度計(jì)下檢測(cè)樣本RNA濃度。在冰上配制反應(yīng)液，并于Thermal Cyclers PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。擴(kuò)增目的基因引物，進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件為95℃ 10min、95℃ 15s、60℃ 1min，循環(huán)40次。使用Bio-Rad CFX Manager1.6 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，利用2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。FOXP3上游引物序列為5′-TACTTCAAGTTCCACAACATGCGACC-3′，下游引物序列為5′-CGCACAAAGCACTTGTGCAGACTCAG-3′，miR-664a-3p上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTATTCATTTATCCCCAGCC-3′，下游引物序列為5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-AGCCACCAGATCCGCGTGT-3′,下游引物序列為 5′-TTGAAGTTCTGGATCAGGA-3′，作為內(nèi)參。

4.Western blot法檢測(cè)FOXP3表達(dá)：按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)組織樣本中FOXP3蛋白表達(dá)，首先通過(guò)BCA法測(cè)定組織中蛋白含量。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜封閉2h。孵育FOXP3一抗(1∶1000)過(guò)夜(4℃)，孵育二抗90min。洗膜后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)FOXP3蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。

5.免疫組化法檢測(cè)FOXP3蛋白表達(dá)：對(duì)組織樣本進(jìn)行石蠟包埋，5μm切片，并通過(guò)二甲苯、乙醇脫蠟處理，放入沸騰的裝有0.01mol/L 檸檬酸緩沖液(pH=6.0)的陶瓷缸中持續(xù)加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌后封閉40min，4℃下過(guò)夜孵育FOXP3一抗(1∶100)，次日PBS沖洗后孵育HRP標(biāo)記的二抗30min，DAB顯色、蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀(guān)察并獲取圖像，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0分析圖像，結(jié)果以平均吸光度值(吸光度值A(chǔ)/陽(yáng)性面積)表示。

6.觀(guān)察指標(biāo)：分析結(jié)腸組織中FOXP3和miR-664a-3p水平與性別、年齡、病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。

結(jié) 果

1.FOXP3 mRNA、miR-664a-3p表達(dá)水平檢測(cè)：首先通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)樣本組織中FOXP3 mRNA、miR-664a-3p水平，UC患者結(jié)腸組織中FOXP3 mRNA(圖1A)、miR-664a-3p(圖1B)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。此外，依據(jù)評(píng)分劃分的輕度、中度和重度患者中，中重度UC患者結(jié)腸組織中FOXP3 mRNA、miR-664a-3p相對(duì)表達(dá)水平相較于輕度患者顯著增高(P<0.01)。

圖1 組織樣本中Foxp3 mRNA和miR-664a-3p相對(duì)表達(dá)水平比較A.FOXP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B.miR-664a-3p相對(duì)表達(dá)水平

2.FOXP3蛋白表達(dá)情況：Western blot法檢測(cè)結(jié)果(圖2A)顯示，相較于對(duì)照組UC組中FOXP3蛋白表達(dá)顯著增加，此結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致。進(jìn)一步進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，據(jù)了解FOXP3免疫陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色則為陽(yáng)性細(xì)胞。圖2B結(jié)果顯示，UC患者結(jié)腸組織中，F(xiàn)OXP3+細(xì)胞顯著多于對(duì)照組(P=0.000)；且中重度患者相較于輕度患者，F(xiàn)OXP3表達(dá)顯著升高(P=0.000)。

3.UC患者結(jié)腸組織中FOXP3、miR-664a-3p表達(dá)與病情相關(guān)性：在驗(yàn)證UC患者結(jié)腸組織中FOXP3和miR-664a-3p明顯高表達(dá)之后，為了研究FOXP3和miR-664a-3p與患者病情的相關(guān)性，根據(jù)FOXP3 mRNA和miR-664a-3p在qPT-PCR結(jié)果中相對(duì)表達(dá)的中位值，將50例樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，每組25例。采用χ2檢驗(yàn)檢測(cè)miR-664a-3p和FOXP3與患者病情的相關(guān)性。UC患者結(jié)腸組織中FOXP3、miR-664a-3p水平與臨床病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(χ2=10.160、13.120)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且結(jié)果與患者性別、年齡、吸煙史均無(wú)關(guān)(P>0.05),詳見(jiàn)表1。

表1 UC患者結(jié)腸組織中FOXP3、miR-664a-3p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

4.FOXP3與miR-664a-3p表達(dá)的相關(guān)性分析：通過(guò)Pearson方法分析組織樣本中FOXP3與miR-664a-3p表達(dá)的相關(guān)性，顯示FOXP3與miR-664a-3p表達(dá)呈正相關(guān)(r2=0.512，P=0.000)，詳見(jiàn)圖3。

圖3 FOXP3與miR-664a-3p表達(dá)相關(guān)性分析

討 論

炎癥性腸病(IBD)是一類(lèi)消化道慢性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(Crohn disease, CD)[10]。UC主要表現(xiàn)為彌漫性腸黏膜及黏膜下炎癥，包括固有層和隱窩內(nèi)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，嚴(yán)重者則導(dǎo)致潰瘍形成。UC的病因復(fù)雜，主要包括遺傳、飲食和環(huán)境等因素[11]。目前，常用的治療手段(如類(lèi)固醇和免疫抑制劑藥物)會(huì)使患者產(chǎn)生不良反應(yīng)[12]。因此當(dāng)前的研究主要集中在減少UC發(fā)生率的預(yù)防措施上。Tregs細(xì)胞是具有免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+T細(xì)胞亞群，能通過(guò)細(xì)胞接觸依賴(lài)或非細(xì)胞接觸依賴(lài)機(jī)制維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，從而影響機(jī)體免疫性疾病、感染、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展[13]。FOXP3在Tregs細(xì)胞的發(fā)育、成熟及生物學(xué)功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。miR-664a-3p在消化道疾病胃癌及其他疾病中顯著高表達(dá)[7]。目前僅發(fā)現(xiàn)miR-664a-3p可以通過(guò)hippo通路靶向MOB1A促進(jìn)胃癌的發(fā)展。本研究中基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-664基因啟動(dòng)子中存在FOXP3結(jié)合區(qū)，F(xiàn)OXP3作為miR-664a-3p的轉(zhuǎn)錄因子可以激活miR-664a-3p的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)展[7]。但目前關(guān)于FOXP3與miR-664a-3p的表達(dá)關(guān)系在UC組織中暫無(wú)研究，因此本研究主要探討FOXP3與miR-664a-3在UC中的表達(dá)水平及其臨床意義。

FOXP3屬于叉頭翅螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑家族，其編碼基因定位于人類(lèi)性染色體Xp11.23。FOXP3編碼的蛋白能夠通過(guò)Forkhead結(jié)構(gòu)域與DNA特定位點(diǎn)結(jié)合，參與對(duì)目的基因的調(diào)控[14]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)，尤其是CD4+CD25+Tregs在抑制免疫反應(yīng)和協(xié)調(diào)免疫耐受中至關(guān)重要[15]。FOXP3可以通過(guò)與關(guān)鍵免疫抑制分子(如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原，CTLA4)的相關(guān)靶基因結(jié)合調(diào)控其表達(dá)水平[16]。此外，F(xiàn)OXP3能夠通過(guò)成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Tregs細(xì)胞轉(zhuǎn)化，影響Tregs的分化和功能[17]。Hori等[18]在此前研究中指出，CD4+CD25-T細(xì)胞中FOXP3的異常表達(dá)能夠賦予Tregs表型以預(yù)防IBD。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3在包括UC在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮著重要作用[19～22]。目前，在UC發(fā)病的分子機(jī)制研究中，多采用結(jié)腸息肉患者作為對(duì)照組[23～25]。有研究顯示，在UC與結(jié)腸息肉患者組織中，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[26,27]。本研究通過(guò)qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)FOXP3表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)UC組FOXP3 mRNA水平顯著高于結(jié)腸息肉患者對(duì)照組(P<0.05)，免疫組化結(jié)果也顯示UC組FOXP3陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。此外，臨床病理特征比較結(jié)果說(shuō)明患者結(jié)腸組織中FOXP3與臨床病情嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，以上結(jié)果一致說(shuō)明FOXP3會(huì)促進(jìn)UC的發(fā)展。

miR-664a-3p在不同疾病中發(fā)揮不同的作用，如Yoneda等[28]通過(guò)微陣列和PCR分析患有牙周炎或健康的受試者的血清miRNA譜，發(fā)現(xiàn)miR-664a-3p在患有牙周炎的受試者中顯著高表達(dá)。Modak等[29]研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，心源性卒中患者中miR-664a-3p的表達(dá)具有差異性。此外，在乳腺癌、宮頸癌和骨肉瘤等疾病中也發(fā)現(xiàn)miR-664a-3p發(fā)揮重要作用[8]。更重要的是，在消化道疾病胃癌中發(fā)現(xiàn)了miR-664a-3p的異常表達(dá)[7]。然而，其在UC中的作用及潛在機(jī)制尚未見(jiàn)研究。本研究通過(guò)qRT-PCR 法檢測(cè)miR-664a-3p水平，結(jié)果顯示UC組中miR-664a-3p表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明miR-664a-3p與UC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。臨床病理特征比較結(jié)果顯示，患者結(jié)腸組織中miR-664a-3p與臨床病情嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明miR-664a-3p可以促進(jìn)UC的發(fā)展。此外，F(xiàn)OXP3與miR-664a-3p表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸組織中FOXP3、miR-664a-3p表達(dá)水平增高，二者呈正相關(guān)，并且與UC疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，可以作為UC診斷的標(biāo)志物，也為研究臨床治療UC的新靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。但本研究未納入細(xì)菌性腸炎、缺血性腸病等其他腸道炎癥性疾病，故無(wú)法全面評(píng)估結(jié)腸FOXP3、miR-664a-3p表達(dá)與UC之間的確切關(guān)系，此外FOXP3、miR-664a-3p在UC發(fā)生過(guò)程中的具體機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究。