類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血腱糖蛋白C與CD4+T細(xì)胞亞群的關(guān)系

王 霞 謝戩芳 柏歡歡 張文琦 郝 楠

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，其特征為滑膜炎與血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。RA的發(fā)生、發(fā)展是諸多淋巴細(xì)胞異常作用的結(jié)果，其中CD4+T細(xì)胞亞群的失衡是導(dǎo)致RA發(fā)病的重要因素[2]。腱糖蛋白C(tenascin-C，TN-C)是一種與組織損傷和重塑相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，在健康成人組織中的表達(dá)非常有限，而在急性炎癥刺激下可特異性表達(dá)上調(diào)，在慢性炎癥及組織重塑過(guò)程中持續(xù)的高表達(dá)，參與包括RA在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病[3～5]。然而，在RA中TN-C與CD4+T細(xì)胞亞群的關(guān)系尚不清楚。本研究主要通過(guò)觀察RA患者外周血TN-C的表達(dá)情況，分析其與CD4+T細(xì)胞亞群的關(guān)系。

資料與方法

1．研究對(duì)象：選取2019年1月～2020年1月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的RA患者130例，其中男性41例，女性89例，患者平均年齡53.66±14.01歲。所有患者均符合2010年ACR/EULAR的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，排除合并其他自身免疫疾病、有嚴(yán)重器官衰竭、感染以及腫瘤患者、嚴(yán)重精神類(lèi)疾病無(wú)法正常溝通者[6]。選擇性別、年齡匹配的健康體檢者40例為對(duì)照組。

2.臨床資料：收集RA患者性別、年齡、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(SJC)及壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(TJC)等一般資料，RF、抗CCP抗體、抗核周因子抗體(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶(GPI)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、CD4+T細(xì)胞亞群(Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞)等相關(guān)化驗(yàn)指標(biāo)。同時(shí)計(jì)算與疾病活動(dòng)相關(guān)的DAS28-ESR評(píng)分，將RA患者分為緩解組28例(DAS28≤2.6)和活動(dòng)組102例(DAS28>2.6)[7]。

3.血清TN-C水平的檢測(cè)：晨起空腹抽取所有受試者肘靜脈血5ml，離心分離血清。采用ELISA檢測(cè)血清TN-C水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cloud-Clone公司。所有步驟均按照儀器規(guī)范和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

結(jié) 果

1．血清TN-C水平的比較：(1)RA患者與對(duì)照組血清TN-C比較：RA患者血清TN-C水平顯著高于對(duì)照組(50.04±8.10ng/ml vs 40.58±4.38ng/ml，P=0.000)。其中活動(dòng)期RA患者血清TN-C水平高于緩解期(50.58±8.31ng/ml vs 48.05±7.08ng/ml)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。(2)RA患者自身抗體陽(yáng)性組與陰性組TN-C比較：RA患者中RF、抗CCP抗體、APF、AKA和GPI的陽(yáng)性數(shù)分別為91、89、76、72和24例，陽(yáng)性率依次為70.0%、68.5%、58.5%、55.4%和18.5%；其中RF、抗CCP抗體陽(yáng)性血清TN-C高于陰性患者(51.23±8.12ng/ml vs 47.25±7.45ng/ml，51.11±8.06ng/ml vs 47.71±7.79ng/ml，P<0.05)，血清TN-C水平與APF、AKA、GPI等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05，表2)。

表1 RA組與對(duì)照組血清TN-C水平比較

表2 RA患者自身抗體陽(yáng)性組與陰性組血清TN-C水平比較

2.ROC曲線分析TN-C價(jià)值：TN-C的AUC為0.89，敏感度為63.10%，特異性為95.00%，95% CI為0.79～0.91(圖1)。

圖1 血清TN-C水平的ROC分析結(jié)果

3.RA患者與對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞亞群比較：通過(guò) ROC曲線確定RA患者血清TN-C的臨界值為46.93ng/ml，根據(jù)該臨界值，將RA患者分為T(mén)N-C正常組(n=35)和TN-C升高組(n=95)，并與對(duì)照組比較所對(duì)應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)及百分比。3組間Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比、Th17/Treg比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組比較，TN-C升高組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比降低，Th17/Treg比值升高(P<0.01)，而TN-C正常組的Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比、Th17/Treg比值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與TN-C正常組比較，TN-C升高組Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比降低，Th17/Treg比值升高(P<0.01，表3)。

表3 3組外周血Th17、Treg細(xì)胞及Th17/Treg比較[M(Q1,Q3)]

4.血清TN-C與CD4+T細(xì)胞亞群、臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析:Spearman相關(guān)分析顯示，RA患者血清TN-C水平與Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比呈負(fù)相關(guān) (r=-0.368、-0.237，P<0.01)，與Th17/Treg比值呈正相關(guān)(r=0.229，P<0.05)。與Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比、ESR、CRP、SJC、TJC、DSA28均無(wú)相關(guān)性(表4)。

表4 RA患者血清TN-C相關(guān)性分析

結(jié) 果

RA是一種以慢性滑膜炎、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征的自身免疫性疾病，具有病程長(zhǎng)、致殘率高、易反復(fù)等特點(diǎn)。目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，免疫細(xì)胞功能紊亂參與RA發(fā)病已達(dá)共識(shí)，其中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞免疫失衡為關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。然而，導(dǎo)致這種失衡的始動(dòng)因素和調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。因此，探究RA發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效治療方法始終是國(guó)內(nèi)外研究關(guān)注的熱點(diǎn)。

TN-C是一種存在于細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，是腱糖蛋白家族中發(fā)現(xiàn)最早且最重要的成員，可因mRNA的選擇性剪接導(dǎo)致性質(zhì)及分子量的變化而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。TN-C在健康成人組織中幾乎不表達(dá)，但在血管形成、傷口愈合、腫瘤發(fā)生及炎癥等過(guò)程中表達(dá)增加[9]。TN-C的表達(dá)受多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、血管活性多肽、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及生物力學(xué)因素的調(diào)節(jié)[10]。研究發(fā)現(xiàn)RA患者滑液中TN-C水平較健康成人及骨關(guān)節(jié)炎患者明顯升高[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中TN-C mRNA的水平較其他細(xì)胞明顯升高，提示此兩種細(xì)胞可能與TN-C的合成有關(guān)[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入TN-C后可以誘導(dǎo)滑膜炎癥的形成，同時(shí)TN-C缺陷型小鼠較野生鼠來(lái)說(shuō)炎癥的嚴(yán)重程度更輕且更容易從關(guān)節(jié)炎癥中康復(fù)[13]。此外，體外培養(yǎng)的滑膜組織中加入TN-C可促進(jìn)IL-6、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清TN-C高表達(dá)，這與既往研究結(jié)果相似[15]。然而，活動(dòng)期RA患者血清TN-C水平僅略高于緩解期，且未發(fā)現(xiàn)血清TN-C與RA患者急性期反應(yīng)物(ESR、CRP)呈相關(guān)性，提示TN-C可能通過(guò)與炎癥無(wú)關(guān)的機(jī)制在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，或者是由于筆者研究的樣本量較少，仍需擴(kuò)大樣本量開(kāi)展進(jìn)一步研究予以證實(shí)。通過(guò)ROC曲線分析TN-C診斷價(jià)值，AUC 為0.89，敏感度為63.10%，特異性為95.00%。敏感度雖不及RF、抗CCP抗體，但其特異性顯著增強(qiáng)，在RA臨床診斷上或許可當(dāng)作一種潛在的輔助檢測(cè)項(xiàng)目。

相關(guān)研究表明，TN-C主要在RA中作為一種損傷相關(guān)分子模式與相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮作用。TN-C的纖維蛋白原樣球狀結(jié)構(gòu)域可與滑膜成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)多種促炎性因子如IL-6、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生，而促炎性因子的產(chǎn)生又可促進(jìn)TN-C的釋放，由此形成一個(gè)惡性炎癥循環(huán)，介導(dǎo)持續(xù)性滑膜炎癥和組織破壞[16]。TN-C的表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域及纖連蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域3～8的TN-C片段可誘導(dǎo)糖胺多糖釋放和聚蛋白多糖酶活性，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解[17]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清TN-C表達(dá)水平與多普勒超聲關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分相關(guān)[18]。RF、抗CCP抗體是目前RA臨床診斷、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后常用指標(biāo)，此外抗CCP抗體陽(yáng)性比陰性RA患者易發(fā)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)骨破環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，RF、抗CCP抗體陽(yáng)性患者血清TN-C水平分別高于陰性患者，提示TN-C可能對(duì)RA骨侵蝕早期診斷和病情評(píng)估具有較高的價(jià)值。目前有關(guān)TN-C在RA中作用機(jī)制的研究尚處于初級(jí)階段，僅涉及與細(xì)胞表面受體的作用。既往研究表明，TN-C與其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及細(xì)胞間黏附因子相互作用在細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞外骨架形成等方面有重要意義[19]。RA中TN-C的作用有待于開(kāi)展分子生物學(xué)方面的研究，同時(shí)TN-C的臨床意義也需開(kāi)展更多臨床實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

隨著TN-C相關(guān)研究的不斷深入，TN-C可能通過(guò)與樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)表面受體結(jié)合，促進(jìn)病理性Th17細(xì)胞分化，誘導(dǎo)IL-17的合成[20]。Machino-Ohtsuka等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TN-C通過(guò)激活DCs和Th17細(xì)胞分化加重自身免疫性心肌炎。Mina等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TN-C可誘導(dǎo)支氣管上皮Th2細(xì)胞釋放大量IL-4、IL-13，導(dǎo)致哮喘的發(fā)生。也有研究表明，三陰性乳腺癌患者高表達(dá)的TN-C與預(yù)后不良相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。本研究中與對(duì)照組、TN-C正常組比較，TN-C升高組Treg細(xì)胞及百分比降低，Th17/Treg比值升高。此外，Spearman相關(guān)分析顯示，RA患者血清TN-C水平與Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比呈負(fù)相關(guān)，與Th17/Treg比值呈正相關(guān)。以上研究可知，Treg細(xì)胞數(shù)量變化、Th17/Treg比值失衡能引起機(jī)體免疫反應(yīng)的異常，導(dǎo)致RA的發(fā)生。此外，TN-C可能在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞分化和Th17/Treg免疫平衡中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，RA 患者血清TN-C高表達(dá)，外周血Th17/Treg失衡，TN-C可能通過(guò)影響Th17/Treg免疫平衡參與 RA 過(guò)程，但二者之間的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。