海藻酸鈉對磷酸鎂骨水泥的理化性質(zhì)及生物相容性的影響

羅文娜 李 威 郭衛(wèi)春

人體骨組織具有再生潛能，對于損傷程度較輕且少量的骨缺損，人體骨組織能夠完成自我修復(fù)，但對于大塊骨缺損，骨組織則難以完成自我修復(fù)[1]。臨床上治療大塊骨缺損主要采用骨移植法。目前，骨移植材料主要包括自體骨、異體骨和人工合成骨[2]。自體骨是治療大塊骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但自體骨來源有限，供骨區(qū)易發(fā)生感染、出血和疼痛等并發(fā)癥，從而限制其在臨床上的使用。盡管異體骨來源相對廣泛，但異體骨移植存在疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險[3,4]。為了克服這些局限性，人們開發(fā)了各種各樣的人工合成骨用以治療大塊骨缺損[5]。

磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)與人體骨組織的無機物具有相似的化學(xué)成分，因而受到研究者的青睞[6]。盡管CPC具有良好的生物相容性，但它也存在一定的局限性，如固化時間過長、抗壓強度較弱以及降解速度過慢[7]。磷酸鎂骨水泥(magnesium phosphate cement, MPC)具有相對較高的力學(xué)性能和可控的降解速率等優(yōu)勢因而備受關(guān)注[8,9]。與CPC比較，MPC具有凝結(jié)快、早期強度高的優(yōu)點，但MPC固化時間過快難以應(yīng)用于臨床[10]。

既往有研究者通過在反應(yīng)體系中加入無機物或有機物對MPC進(jìn)行改性以達(dá)到延長固化時間的效果，使其滿足臨床操作需求[4,11]。海藻酸鈉(sodium alginate, SA)是從馬尾藻或海帶中提取出來的一種高分子有機化合物，目前對于SA改性MPC的研究鮮有報道。因此，本研究希望通過在反應(yīng)體系中加入不同濃度的SA，調(diào)節(jié)MPC的固化時間至合適的范圍，同時探討SA對MPC的理化性能及生物相容性的影響。

材料與方法

1.材料與試劑：輕質(zhì)氧化鎂(MgO)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司，海藻酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，成骨細(xì)胞MC3T3-E1購自國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫，CCK-8試劑盒購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司，鬼筆環(huán)肽購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2.骨水泥的制備：MPC包括固相和液相，固相由重?zé)齅gO和KH2PO4組成，MgO和KH2PO4以1.5∶1.0的摩爾比例混合而成，分別在固相中添加1.0%、2.5%和5.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SA粉末。重?zé)齅gO由輕質(zhì)MgO在1600℃煅燒3h獲得。重?zé)齅gO與KH2PO4在球磨儀中研磨后過200目篩處理，得到樣品粉末并干燥保存。液相由去離子水組成。將固相液以2g/ml比例混合，均勻攪拌成糊狀，隨后將骨水泥轉(zhuǎn)移至模具中制備不同大小的骨水泥樣品。使用直徑為6mm、高度為12mm的模具制備出圓柱狀樣品，用于理化性質(zhì)檢測；使用直徑為6mm、厚度為1mm的模具制備出圓盤狀樣品，用于后續(xù)細(xì)胞實驗。根據(jù)海藻酸鈉含量的不同，將制備的骨水泥樣品記為SA-MPC1, SA-MPC2.5和SA-MPC5，未添加海藻酸鈉的MPC作為對照組。

3.骨水泥形貌檢測：將制備的骨水泥樣品置于37℃，100%濕度條件下養(yǎng)護(hù)2天。取出樣品放入干燥箱內(nèi)干燥，隨后將樣品放入離子濺射樣品臺上噴金30s，掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌結(jié)構(gòu)。

4.固化時間測定：根據(jù)國標(biāo)GB/T1346-2001，采用維卡儀測定固化時間。測定時，試針垂直自由地沉入水泥漿體，觀察試針讀數(shù)。從固液相混合開始計時，到進(jìn)入漿體的試針讀數(shù)不超過1mm，該段時間即為固化時間。每組樣品測試3次。

5.抗壓強度測定：采用萬用材料測試儀測量骨水泥的抗壓強度。取出養(yǎng)護(hù)2天的樣品，將樣品兩端磨平，然后用萬用材料測試儀以1mm/min的加載速度測量骨水泥抗壓強度。每組樣品測試3次。

6.降解速率和pH值測定：將養(yǎng)護(hù)2天的骨水泥樣品取出并烘干，記錄其初始質(zhì)量為M0。降解液為磷酸鹽緩沖鹽水(Tris-HCl, pH7.4)將骨水泥樣品與降解液按照0.05g/ml比例置于無菌試管中，并放置于37℃恒溫水浴箱中。在固定時間點(第1、3、7、14、21、28天)將骨水泥樣品取出，去離子水清洗3次，60℃烘箱中干燥6h，隨后測量樣品重量并記錄為M1。同時，用pH值儀測定溶液的pH值。每組樣品測試3次。降解速率記為D=(M0-M1)/M0×100%。

7.細(xì)胞增殖檢測：采用CCK8法評估MC3T3-E1細(xì)胞增殖情況。將制備好的圓盤狀骨水泥樣品用環(huán)氧乙烷滅菌，并放置在通風(fēng)干燥處7天以去除殘留的環(huán)氧乙烷氣體。隨后，將樣品放置于96孔板內(nèi)，緩慢加入配制好的培養(yǎng)基濕潤樣品。MC3T3-E1細(xì)胞以1×104的密度接種在樣品表面上，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)基。在固定時間點(第1、3、5天)，向每孔加入10μl CCK-8溶液并將孔板在培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h。最后，從每孔中取出100μl培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，96孔板在酶標(biāo)儀中于450nm處測定吸光度。

8.細(xì)胞黏附檢測：MC3T3-E1細(xì)胞在樣品上培養(yǎng)5天后，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗樣品，然后用4%多聚甲醛溶液固定4h，梯度乙醇脫水，真空干燥后噴金，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞黏附情況。

9.細(xì)胞形態(tài)檢測：MC3T3-E1細(xì)胞在樣品上培養(yǎng)5天后，4%多聚甲醛溶液固定15min, PBS清洗細(xì)胞3次，滴加0.1%TRITON，破膜20min。隨后，滴加50μl鬼筆環(huán)肽工作液，室溫孵育2h，PBS清洗3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10min。激光共聚焦顯微鏡拍照觀察細(xì)胞形態(tài)情況。

結(jié) 果

1.骨水泥形貌結(jié)構(gòu)：通過掃描電子顯微鏡觀察到，MPC表面有較多裂紋，裂紋大且寬。隨著SA含量的增加，SA-MPC表面逐漸變得平滑，且裂紋逐漸變細(xì)變窄，微觀結(jié)構(gòu)逐漸變得致密，詳見圖1。

圖1 骨水泥掃描電鏡照片(×500)A.MPC;B.SA-MPC1;C.SA-MPC2.5;D.SA-MPC5

2.固化時間和抗壓強度：隨著反應(yīng)體系中SA含量的增加，骨水泥的固化時間逐漸延長。骨水泥的固化時間由6.13±0.86min延長至16.43±1.50min(圖2A)。骨水泥的抗壓強度隨著SA含量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。MPC的抗壓強度為16.26±1.04MPa， SA-MPC2.5的抗壓強度最高，達(dá)到28.33±1.76MPa， SA-MPC5的抗壓強度稍下降，為25.20±2.25MPa(圖2B)。

圖2 不同組分SA對固化時間和抗壓強度的影響A.固化時間；B. 抗壓強度。與MPC比較，*P<0.05

3.降解速率和pH值變化情況：各組骨水泥的降解速率隨著時間延長逐漸增加，且添加SA的骨水泥降解速率均高于MPC組。隨著SA含量的增加，降解速率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。各組降解速率相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖3A)。各組骨水泥的pH值變化趨勢相同，隨著時間延長pH值逐漸上升，且前7天上升趨勢更快，而后逐漸趨于平穩(wěn)。此外，隨著SA含量的增加，pH值呈逐漸下降趨勢(圖3B)。

圖3 不同組分SA對降解速率和pH值的影響A.降解速率；B.pH值

4.細(xì)胞增殖：隨著時間的延長，各組細(xì)胞數(shù)均呈現(xiàn)增長趨勢，在實驗第3天和第5天，SA-MPC2.5和SA-MPC5兩組細(xì)胞數(shù)高于MPC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 不同組分SA對細(xì)胞增殖的影響與MPC比較，*P<0.05

5.細(xì)胞黏附和形態(tài)：掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，MC3E3-E1細(xì)胞在各組骨水泥表面上均能夠黏附生長，但在添加SA后，細(xì)胞胞體變大，細(xì)胞偽足多且長，彼此物理接觸較多(圖5A)。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，各組細(xì)胞核未見明顯異常，細(xì)胞鋪展良好，與MPC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5B)。

圖5 不同組分SA對細(xì)胞黏附和細(xì)胞形態(tài)的影響A.細(xì)胞黏附(×1000)；B.細(xì)胞形態(tài)(×200)

結(jié) 果

作為骨修復(fù)材料，固化時間是一個重要參考指標(biāo)[12,13]。既要給臨床醫(yī)生提供足夠的操作時間，又要在合適的時間內(nèi)固化[14]。目前，對于固化時間的范圍尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)研究者認(rèn)為固化時間控制在8～15min比較符合臨床操作要求[15]。磷酸鎂骨水泥的反應(yīng)機制是基于酸堿中和的快速水化反應(yīng)，其固化時間較短因而難以應(yīng)用于臨床。在本研究中，骨水泥的固化時間隨著SA的含量增加而逐漸延長，當(dāng)SA的添加量為2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，骨水泥的固化時間延長至12min左右，介于上述范圍內(nèi)，能夠滿足臨床操作需要。在本研究中SA起到了緩凝劑的作用，可能的原因是SA作為一種有機物，在加入到反應(yīng)體系后能包裹在氧化鎂的表面，延緩鎂離子的釋放速度，進(jìn)而延緩酸堿中和反應(yīng)速度。

作為骨組織填充材料，骨水泥需要有足夠的抗壓強度才能應(yīng)用于人體負(fù)重骨組織中[16]。Sprio等[11]研究發(fā)現(xiàn)在摻鍶磷酸鈣骨水泥中添加海藻酸鹽可以顯著提高骨水泥的抗壓強度。本研究中骨水泥的抗壓強度隨著SA含量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中SA-MPC2.5的抗壓強度最高，達(dá)到28.33±1.76MPa。根據(jù)掃描電子顯微鏡結(jié)果，推測可能原因是SA能夠填充在MPC的縫隙中，減少縫隙數(shù)量，使骨水泥的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，從而引起抗壓強度的增加。但當(dāng)進(jìn)一步增加SA添加量時，骨水泥的抗壓強度卻下降，可能原因是SA的強度在骨水泥中占據(jù)主導(dǎo)地位，從而導(dǎo)致抗壓強度的下降。但對于SA如何影響抗壓強度的變化仍需進(jìn)一步探討。

骨修復(fù)材料應(yīng)具有生物可降解性，以便材料在降解的同時逐漸被新生骨組織替代[17]。本研究中各組骨水泥降解趨勢相似，且隨著SA含量的增加降解速率逐漸增加?？赡茉驗?①與MPC比較，SA具有相對較高的溶解度，這使得SA在Tris-HCl中更易于降解;②隨著SA的降解，會在骨水泥中留下很多微小的孔洞，使水分子很容易進(jìn)入到骨水泥的內(nèi)部破壞微觀結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致降解速率增加。pH值是影響細(xì)胞活性的重要因素，過酸或過堿的環(huán)境都不利于細(xì)胞的生長。MPC中由于含有未反應(yīng)的MgO，會在溶液中形成Mg(OH)2，從而增加pH值，使溶液偏堿性。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)SA的加入降低了溶液pH值，可能原因是SA含有大量羧基，能夠釋放出H+，進(jìn)而降低pH值。因此，通過調(diào)整反應(yīng)成分，能夠獲得不同降解速率和pH值的骨水泥。

良好的生物相容性是人體植入材料的一項必備條件[18]。理想的骨修復(fù)材料除了具有良好的生物相容性，還應(yīng)具有刺激細(xì)胞和組織生長的生物活性。本研究采用CCK-8法評估骨水泥對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果提示各組骨水泥樣品對細(xì)胞沒有毒性，但添加SA后的骨水泥更有利于細(xì)胞增殖。此外，細(xì)胞黏附和形態(tài)結(jié)果顯示，在添加SA的骨水泥上細(xì)胞胞體變大，偽足多且長，彼此物理接觸較多，提示SA更加有利于細(xì)胞生長。以上研究結(jié)果顯示，添加SA的骨水泥沒有細(xì)胞毒性，且具有良好的生物相容性。

綜上所述，SA可有效改善MPC的理化性能，能夠調(diào)節(jié)MPC的固化時間至合適范圍并使其具有理想的抗壓強度，同時能夠調(diào)節(jié)降解速率和pH值使其滿足臨床需求。此外，生物學(xué)實驗表明SA改性的MPC具有良好的生物相容性，有潛在的臨床應(yīng)用價值。