利用InSyTe FLECT/CT成像技術(shù)動態(tài)觀察急性肺結(jié)核小鼠感染模型的構(gòu)建

李軍麗 石亞男 占玲俊

闡明結(jié)核病發(fā)病機(jī)制，評估抗結(jié)核新藥、疫苗和診斷試劑的實(shí)驗(yàn)研究中，動物模型是最有效且不可或缺的工具。目前，結(jié)核病小鼠模型的建立主要通過氣溶膠霧化吸入、滴鼻、腹腔注射及尾靜脈注射等常用感染方法，評價(jià)模型建立成功與否的金標(biāo)準(zhǔn)則是依照科赫法則(koch postulates)對靶器官荷菌量進(jìn)行檢測[1～3]。而就小鼠的數(shù)量、ABSL-3實(shí)驗(yàn)室空間以及實(shí)驗(yàn)過程中不同時(shí)間點(diǎn)獲取和培養(yǎng)的動物組織所需其他資源而言，依賴靶器官菌落形成單位(colony-forming units，CFU)計(jì)數(shù)的常規(guī)終點(diǎn)即繁瑣又昂貴，且增加了操作過程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，需要3～4周時(shí)間才能在固體培養(yǎng)基上形成肉眼可見的菌落，這嚴(yán)重阻礙了結(jié)核病疫苗和藥物的研發(fā)速度。因此，需要一種可靠的非侵入性實(shí)時(shí)定量方法，可以在體外和活體動物中定量分析活的結(jié)核分枝桿菌，以縮短預(yù)防和治療藥物的篩選周期。

活體動物體內(nèi)光學(xué)成像是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，通過活體生物發(fā)光或熒光成像，研究者能夠直接觀測熒光標(biāo)記的活細(xì)胞或病原體在動物體內(nèi)的生物學(xué)行為，目前已成為廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域的前沿技術(shù)[4,5]。該技術(shù)對疾病動物模型微小病灶的檢測敏感度極高，能夠進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動態(tài)的動物活體觀察，能更加準(zhǔn)確地反映傳染病動物模型中病原體在宿主體內(nèi)定位及增殖情況，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀可靠[6,7]。此外，對同一實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的反復(fù)跟蹤和動態(tài)觀察，避免實(shí)驗(yàn)動物間的個(gè)體差異及減少實(shí)驗(yàn)動物的使用量，使科學(xué)研究更加符動物實(shí)驗(yàn)倫理中有關(guān)動物福利的替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則[8]。

目前，各種熒光素酶生物標(biāo)記的細(xì)菌已用于高通量篩選抗生素和對分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)，且取得了不少成果[9,10]。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)近紅外熒光蛋白的減毒牛型結(jié)核分枝桿菌，并利用InSyTe FLECT/CT多模態(tài)成像平臺中將熒光斷層成像與X線CT掃描相結(jié)合的優(yōu)勢，對不同感染途徑下急性肺結(jié)核小鼠感染模型的建立進(jìn)行可視化動態(tài)觀察，為分枝桿菌在體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移及結(jié)核病治療研究提供理想的動物模型。

材料與方法

1.質(zhì)粒、菌種與動物：pMV261質(zhì)粒，E.coli DH5α，Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2由上海晶諾生物科技有限公司提供，RAW264.7細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。6～8周齡SPF級雌性C57BL/6N小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK (京)-2016-0006]。

2.主要試劑：7H9培養(yǎng)基、7H10培養(yǎng)基、Middlebrook OADC增菌液購自美國BD公司，T4 DNA連接酶、Fast Digest HindⅢ、Fast Digest EcoRⅠ、Phusion?High Fidelity DNA Polymerase (2U/μl)購自美國Thermo Fisher公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物公司，膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒購自美國Omega公司，Trans2K Plus Ⅱ DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3.熒光質(zhì)粒構(gòu)建：高保真聚合酶Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase PCR擴(kuò)增iRFP720基因，引物iRFP720-FP/iRFP720-RP分別為：5′-TCCAGCTGCAGAATTCATGGCTGAAGGATCCGTCGC-3′/5′-CGACATCGATAAGCTTTCACTCTTCCATCACGCCGA-3′，反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參考產(chǎn)品說明書。擴(kuò)增目的DNA片段后，瓊脂糖核酸凝膠電泳回收純化目的DNA片段?；厥蘸蟮哪康腄NA片段與EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切線性化的pMV261質(zhì)粒經(jīng)無縫克隆重組并轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆子pMV261-iRFP720并測序驗(yàn)證，陽性質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

4.BCG感受態(tài)菌株制備：挑取新鮮的Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2(簡稱BCG)單菌落接種于5ml 7H9 + OADC液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)3～4周，至菌體的對數(shù)生長期(A600為0.6左右)。室溫5000r/min離心10min收集菌體，10%無菌甘油洗滌菌體3次，最后經(jīng)10%無菌甘油重懸菌體，每管200μl分裝置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5.電擊轉(zhuǎn)化BCG感受態(tài)細(xì)胞：10μl陽性pMV261-iRFP720質(zhì)粒加入200μl BCG感受態(tài)菌株中，混勻后室溫靜置10min，隨后轉(zhuǎn)入2mm電轉(zhuǎn)杯中電擊，電擊參數(shù)為：電壓2.5kV, 電阻1000Ω，電容25μF。電擊完畢后，立即加入1ml 7H9+OADC液體培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇12h。室溫5000r/min離心10min，棄上清，200μl 7H9+OADC液體培養(yǎng)基重懸菌體并均勻涂布至含25μg/ml卡那霉素的7H10+OADC固體平板，37℃恒溫培養(yǎng)。

6.BCG-iRFP720熒光菌株驗(yàn)證：37℃培養(yǎng)3～4周后，挑取單克隆菌株接種至含25μg/ml卡那霉素的7H9 + OADC液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4～5周，收集菌體煮沸裂解，以裂解液為模板，PCR驗(yàn)證質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入菌株中，陽性菌株即為構(gòu)建成功的Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株(簡稱BCG-iRFP720)。PCR驗(yàn)證引物JDFP/JDRP分別為：5′-GTGGCAGCGAGGACAACTTG-3′/5′-CCCGACGTCAGGTGGCTAG-3′。

7.熒光菌株體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：RAW264.7細(xì)胞傳代至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×105cells/ml，100微升/孔)，37℃、5% CO2培養(yǎng)5～6h。300μl DMEM培養(yǎng)基洗去未貼壁細(xì)胞，每孔細(xì)胞補(bǔ)加500μl DMEM完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入100μl(1×106CFU/ml)BCG-iRFP720熒光菌株。呈米字形搖勻后，37℃分別靜置培養(yǎng)24h和48h，300μl無菌PBS洗去凋亡細(xì)胞和未被吞噬的熒光菌株，隨后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

8.熒光菌株體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)：C57BL/6N小鼠隨機(jī)分成3組，即空白對照組、熒光菌株腹腔注射感染組和熒光菌株尾靜脈注射感染組，每組6只小鼠。腹腔注射和尾靜脈注射感染組分別經(jīng)腹腔和尾部靜脈注射100μl(1×107CFU/ml)BCG-iRFP720熒光菌株，而空白對照組接種等劑量BCG菌株。感染后1、3、5和7天分別進(jìn)行InSyTe FLECT/CT活體成像。同時(shí)，解剖感染后7天小鼠肝臟、脾臟和肺進(jìn)行器官離體熒光成像進(jìn)行驗(yàn)證。全部動物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)筆者單位實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLJ2019001。

結(jié) 果

1.BCG-iRFP720熒光菌株構(gòu)建及驗(yàn)證：目的基因iRFP720與經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的游離型載體pMV261質(zhì)粒重組，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。抽提質(zhì)粒并測序驗(yàn)證，陽性質(zhì)粒pMV261-iRFP720通過電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入BCG菌株中，獲得熒光菌株，最終通過利用載體上來源于結(jié)核分枝桿菌的hsp60基因啟動子實(shí)現(xiàn)iRFP720基因的表達(dá)(圖1A)。以抗卡那霉素單克隆陽性BCG菌體裂解液為模板，PCR驗(yàn)證電泳結(jié)果顯示，pMV261-iRFP720質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入BCG菌株，獲得BCG-iRFP720熒光菌株(圖1B)。

圖1 BCG-iRFP720熒光菌株構(gòu)建及PCR驗(yàn)證A.Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株構(gòu)建流程；B.PCR驗(yàn)證pMV261-iRFP720質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BCG菌株；M.DNA marker；1.PCR驗(yàn)證BCG中含有pMV261-iRFP720質(zhì)粒

2.BCG-iRFP720在體外細(xì)胞中的熒光信號：pMV261-iRFP720質(zhì)粒導(dǎo)入BCG菌株，使得該菌株具備激發(fā)出紅色熒光的特性，不同濃度菌懸液熒光成像顯示，菌體紅色熒光明顯(圖2A)。為進(jìn)一步檢測在細(xì)胞水平下該菌株的熒光表達(dá)情況，對數(shù)生長期熒光菌株BCG-iRFP720以MOI為10感染RAW264.7細(xì)胞，37℃共孵育24h和48h后，分別進(jìn)行熒光顯微觀察。如圖2B所示，BCG-iRFP720熒光菌株侵染RAW264.7巨噬細(xì)胞后可在細(xì)胞中持留并可見明顯紅色熒光。同時(shí)，被BCG-iRFP720熒光菌株感染的細(xì)胞形態(tài)均有變圓趨勢，但隨著吞噬時(shí)間的延長，紅色熒光強(qiáng)度有所減弱。

圖2 BCG-iRFP720菌體及其在RAW264.7胞內(nèi)熒光強(qiáng)度檢測A.不同濃度Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2:: pMV261-iRFP720菌株(1×108CFU/ml到1×103CFU/ml, 100微升/孔)自體熒光強(qiáng)度檢測；B.對數(shù)生長期Mycobacterium bovisBCG str. Pasteur 1173P2:: pMV261-iRFP720熒光菌株感染RAW264.7巨噬細(xì)胞24和48h后，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度檢測

3.腹腔注射BCG-iRFP720在活體動物上的熒光信號：小鼠經(jīng)腹腔注射感染BCG-iRFP720熒光菌株后，InSyTe FLECT/CT小動物多模態(tài)光學(xué)成像系統(tǒng)分析其在680通道波段(激發(fā)波長為670nm，發(fā)射波長為690～740nm)下的活體熒光成像。結(jié)果顯示，BCG-iRFP720菌株注射后1、3、5和7天小鼠腹腔均可見明顯熒光。隨著注射感染時(shí)間延長，菌株開始由腹腔注射部位遷移擴(kuò)散至胸腔及其他部位。并在感染后的第5天，可見胸腔肺部明顯熒光(圖3)。

圖3 腹腔注射BCG-iRFP720菌株后小鼠活體熒光成像小鼠經(jīng)腹腔注射100μl的1×107CFU/ml Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株后，不同時(shí)間點(diǎn)(1、3、5和7天)小鼠活體熒光成像分析。上圖為小鼠正位三維圖像，下圖為小鼠肺部CT斷層圖像(橫斷面)

4.尾靜脈注射BCG-iRFP720在活體動物上的熒光信號：BCG-iRFP720菌株經(jīng)腹腔注射感染后第5天，熒光菌株由腹腔擴(kuò)散至肺部，為進(jìn)一步比較不同感染途徑在建立急性肺結(jié)核模型上的差異，同等劑量熒光菌株經(jīng)尾靜脈注射感染小鼠并進(jìn)行活體熒光成像動態(tài)觀察。尾靜脈注射感染后第1天，小鼠胸腔肺部即出現(xiàn)明顯熒光，且隨著感染時(shí)間的延長，肺部熒光逐漸增強(qiáng)(圖4)。表明尾靜脈注射感染后熒光菌株隨血液循環(huán)至小鼠各臟器部位，且感染后1天左右即可構(gòu)建急性肺結(jié)核小鼠感染模型。

圖4 尾靜脈注射BCG-iRFP720菌株后小鼠活體熒光成像小鼠經(jīng)尾靜脈注射100μl的1×107CFU/ml Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株后，不同時(shí)間點(diǎn)(1、3、5和7天)小鼠活體熒光成像分析。上圖為小鼠正位三維圖像，下圖為小鼠肺部CT斷層圖像(橫斷面)

5.BCG-iRFP720在離體器官上的熒光信號：為明確和驗(yàn)證不同感染途徑下BCG-iRFP720熒光菌株在小鼠體內(nèi)的分布情況，小鼠感染后7天，解剖分離肺、脾臟和肝臟進(jìn)行離體組織器官熒光成像。腹腔注射感染后7天，BCG-iRFP720熒光菌株由腹腔擴(kuò)散遷移至肺部和肝臟，離體器官熒光成像顯示肺部和肝臟呈現(xiàn)明顯紅色熒光，但未見脾臟紅色熒光出現(xiàn)(圖5A)。尾靜脈注射感染后7天，BCG-iRFP720熒光菌株迅速擴(kuò)散遷移至肺、肝臟和脾臟，熒光成像可見肺、脾臟、肝臟等組織器官呈現(xiàn)明顯紅色熒光，且肝臟熒光強(qiáng)度更顯著(圖5B)。

圖5 不同感染途徑下BCG-iRFP720菌株在小鼠肺、脾臟和肝臟分布情況小鼠經(jīng)腹腔和尾靜脈注射100μl的1×107 CFU/ml Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720熒光菌株后7 天，解剖分離小鼠肺、脾臟和肝臟進(jìn)行離體器官熒光成像分析

結(jié) 果

活體動物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光成像與熒光發(fā)光成像兩種技術(shù)[11]。生物發(fā)光是將熒光素酶基因(luciferase)整合到細(xì)胞染色體上，使熒光素酶得到持續(xù)表達(dá)。觀察前經(jīng)外源途徑注射其底物-熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。該類酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，且注射一次熒光素只能保持體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30～45min。熒光發(fā)光則有多種方式，既可以將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)等熒光報(bào)告基團(tuán)或其突變體基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光蛋白，在激發(fā)光源的作用下而發(fā)光，也可以利用一些熒光染料標(biāo)記特定的物質(zhì)，注入小動物體內(nèi)而發(fā)光。相比生物發(fā)光，熒光發(fā)光成像具有發(fā)光持續(xù)性強(qiáng)、無需外源反應(yīng)底物或輔助因子參與、費(fèi)用低廉且操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。

近紅外熒光蛋白是基于光敏素蛋白改造的新型熒光蛋白，近紅外光源波長范圍為700～900nm，為人類最早發(fā)現(xiàn)的非可見光區(qū)域[12]。本研究將近紅外熒光蛋白基因iRFP720克隆至游離型載體pMV261質(zhì)粒，最終電轉(zhuǎn)至減毒牛型結(jié)核分枝桿菌，通過利用pMV261載體上來源于結(jié)核分枝桿菌的hsp60基因啟動子實(shí)現(xiàn)iRFP720基因的表達(dá)。體外菌體、胞內(nèi)感染以及動物體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)均表明，在激發(fā)波長為670nm，發(fā)射波長為690～740nm，構(gòu)建的熒光菌株均能被有效激發(fā)出紅色熒光，且持續(xù)時(shí)間較長。熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光，動物體內(nèi)很多物質(zhì)如皮毛、血液和脂肪等在受到激發(fā)光激發(fā)后也會發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測敏感度[13]。但研究表明，機(jī)體在近紅外光波段的吸收系數(shù)最小、自發(fā)熒光最弱且相比于藍(lán)綠光其在體內(nèi)的穿透性效率高[14～16]。因此，利用表達(dá)的iRFP作為標(biāo)志物，對細(xì)菌等生物基本功能單位在空間和時(shí)程上的改變進(jìn)行活體熒光成像成為最佳選擇。

在結(jié)核病研究中，新型抗結(jié)核藥物的迫切需求促使藥物快篩創(chuàng)新方法的出現(xiàn)以加快藥物開發(fā)進(jìn)程[17～19]。傳統(tǒng)的結(jié)核病小鼠模型在抗結(jié)核藥物快速篩選早期存在顯著瓶頸，部分原因是動物模型中結(jié)核菌負(fù)擔(dān)以靶器官組織勻漿CFU來衡量，而結(jié)核分枝桿菌在體外復(fù)制時(shí)間長，固體培養(yǎng)基上生長成肉眼可見菌落可能需要長達(dá)4周左右。InSyTe FLECT/CT多模態(tài)成像系統(tǒng)采用業(yè)界首創(chuàng)的旋轉(zhuǎn)機(jī)架式全角度熒光斷層成像技術(shù)，可以在完整的360°范圍內(nèi)獲取CT和熒光數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)深層組織的無放射性同位素分子成像[20]。同時(shí)，其高敏感度、非損傷性、獲取時(shí)間短、可實(shí)時(shí)提供疾病進(jìn)展和治療效果替代讀數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了上述傳統(tǒng)方法所處的困境，特別適合在小鼠中快速篩選候選藥物。本研究利用構(gòu)建成功的近紅外BCG-iRFP720熒光菌株，借助InSyTe FLECT/CT多模態(tài)成像系統(tǒng)觀察腹腔注射和尾靜脈注射感染途徑下熒光菌株在體內(nèi)的分布情況，一方面比較兩種感染途徑在建立急性肺結(jié)核感染模型中的差異，利用其可視化的優(yōu)點(diǎn)，準(zhǔn)確定位菌株到達(dá)小鼠肺部情況。另一方面，充分獲取InSyTe FLECT/CT多模態(tài)成像系統(tǒng)各類分析參數(shù)，為下一步長期觀察H37Ra、H37Rv等有毒分枝桿菌可視化模型奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)近紅外熒光蛋白的減毒牛型結(jié)核分枝桿菌菌株，并且運(yùn)用InSyTe FLECT/CT多模態(tài)成像系統(tǒng)對不同感染途徑構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行了比較觀察，為結(jié)核藥物快速篩選提供了可視化模型，也為今后在疾病模型研究中選擇實(shí)驗(yàn)動物的活體影像學(xué)監(jiān)測手段積累經(jīng)驗(yàn)。