Transferrin在小鼠腦缺血再灌注損傷中的表達及其意義

張 敏 王志維

心臟血管外科體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)后腦損傷主要表現(xiàn)為腦卒中、認知功能障礙及術后譫妄。心臟外科手術體外循環(huán)后腦缺血再灌注損傷是心臟血管外科患者術后預后不良的主要因素之一[1]。有研究表明，高齡(>65歲)、女性、糖尿病史、高血壓史是影響CPB后腦缺血再灌注損傷的重要因素[2,3]。因此，降低CPB術后腦損傷的發(fā)生率，緩解CPB 術后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是現(xiàn)今心臟血管外科CPB術后亟需攻克的難題。

鐵元素是人體所需微量元素中含量最高的元素之一，與人體健康和疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是人體內(nèi)三羧酸循環(huán)及細胞呼吸相關酶類不可或缺的輔助因子。研究表明，在缺血條件下，大腦處于缺氧狀態(tài)，腦組織所需氧含量增加，導致機體腦組織對鐵元素需求增加[4]。此外，老年人作為顱內(nèi)出血的主要發(fā)病人群，去鐵胺能加速老年顱腦損傷患者顱內(nèi)血腫的吸收并抑制腦部水腫[5]。因此，轉鐵蛋白(transferrin,TF)對維持腦組織細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)、保障鐵離子準確、穩(wěn)定轉運至機體細胞極為關鍵。現(xiàn)今，對于TF在腦缺血再灌中的作用的相關研究較為匱乏，理清鐵穩(wěn)態(tài)及相關鐵代謝蛋白在腦缺血再灌注損傷中的作用，對于臨床心臟血管外科CPB術后腦缺血再灌注損傷防治有著重要意義。

材料與方法

1.動物模型構建與分組：12只雄性C57BL/6J小鼠購自湖北省疾病控制中心。小鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組(Sham組)和腦缺血再灌注組(IR組)，每組6只，飼養(yǎng)于湖北省人民醫(yī)院動物實驗中心。小鼠稱重后腹腔注射戊巴比妥(80mg/kg)進行麻醉。待小鼠角膜反射消失后，將麻醉小鼠仰臥固定于操作臺，頸部正中切口分離右頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸外動脈(external carotid artery, ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery, ICA)和迷走神經(jīng)。近心端結扎CCA，動脈夾夾閉右CCA遠心端，顯微鏡下，在動脈夾與近心端結扎處之間顯微鑷作一切口，插入線栓，取下動脈夾，向ICA方向緩緩推進。當推入阻力顯著增強則立即停止插入，活結絲線固定線栓。缺血2h后拔出線栓，縫合手術切口，再灌24h。Sham組不插入線栓，其他操作與IR組一致。模型構建完成后，預冷0.9%氯化鈉注射液經(jīng)心臟灌注，除去體內(nèi)血液，以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定各組小鼠腦組織標本，石蠟包埋切片，待后續(xù)實驗檢測。

2.實驗細胞：源自大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的PC12細胞系購自武漢大學細胞典藏中心，PC12細胞以含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，5%馬血清(horse serum，HS)及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置于5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中。細胞缺氧復氧前棄去細胞原有培養(yǎng)基，PBS洗去剩余培養(yǎng)基，加入無糖無血清DMEM培養(yǎng)基，將細胞放入三氣培養(yǎng)箱，缺氧后換正常培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱復氧12h。其后收集細胞進行檢測。通過PC12細胞缺氧復氧在體外模擬腦缺血再灌注病理生理環(huán)境，分為對照組(control組)、給予三氣培養(yǎng)箱缺氧復氧組(HR組)、Transferrin重組蛋白處理組(TF組)和Transferrin處理后進行缺氧復氧組(HR+TF組)。

3.實驗試劑：anti-Transferrin一抗、anti-TFR1一抗和anti-FPN1一抗均購自武漢Proteintech生物技術公司。anti-GAPDH一抗和免疫組化試劑盒購自武漢塞維爾生物公司。BCA試劑盒購自上海碧云天生物科技公司。Tunel試劑盒購自上海翊圣生物公司。

4.免疫組化：組織切片常規(guī)脫蠟、水化。0.2%Triton破膜15min，PBS洗3次，每次5min，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復，3%H2O2室溫下封閉組織內(nèi)過氧化物酶，山羊血清封閉1h，封閉完畢后，血清棄去不洗，一抗4℃孵育過夜，次日清洗后，二抗室溫孵育1h。DAB顯微鏡下顯色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

5.免疫熒光：細胞爬片，按照實驗分組要求處理完畢后，棄去培養(yǎng)基，預冷PBS洗去殘留培養(yǎng)基，棄去PBS，4%多聚甲醛固定5min，PBS洗3遍，每次5min。0.2%Triton破膜10min，山羊血清封閉1h，血清棄去不洗，一抗4℃孵育過夜，洗去非特異性結合一抗。二抗常溫孵育1h，洗去非特異性結合二抗，DAPI復染，抗熒光淬滅封片劑封片，全自動熒光顯微鏡下觀察并拍照。

6.Tunel染色：細胞爬片，按照實驗分組要求處理完畢后，棄去培養(yǎng)基，預冷PBS洗去殘留培養(yǎng)基，棄去PBS，4%多聚甲醛固定5min。按照試劑盒操作說明書進行操作，其后以抗熒光淬滅封片劑封片，全自動熒光顯微鏡下隨機選取5個視野進行統(tǒng)計分析。

7.Western blot法檢測：細胞處理完畢后，預冷PBS洗去殘余培養(yǎng)基，胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化，收集消化所得細胞混懸液，1000r/min離心5min，棄上清。PBS重懸細胞，洗去殘余培養(yǎng)基，1000r/min離心5min，棄上清，加入適量體積含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解10min。超聲后在預冷冷凍離心機內(nèi)以離心。取上清，BCA法測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴15min，蛋白樣品制備完成后凍存于-80℃冰箱。制備10%濃度的SDS-PAGE凝膠，每孔蛋白上樣量為20μg，濃縮膠電壓65V，分離膠電壓90V進行電泳；200mA恒流電轉2h，一抗4℃孵育過夜；二抗常溫孵育1h，Odessy熒光成像系統(tǒng)掃膜，所獲條帶以Image J進行半定量統(tǒng)計分析。

結 果

1．腦缺血再灌注對鐵代謝相關蛋白表達的影響：通過免疫組織化可見，IR組TF表達較對照組顯著上調(diào)；IR組TFR1、FPN1蛋白表達較對照組顯著降低。表明鐵轉運相關蛋白在腦缺血再灌過程中有著極為重要的作用(圖1)。

圖1 小鼠腦缺血再灌后TF、TFR1、FPN1的表達變化免疫組化染色，×400

2.PC12細胞系缺氧復氧對鐵代謝相關蛋白表達的影響：通過Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，PC12細胞缺氧復氧后，HR組TF表達較對照組顯著上調(diào)；HR組TFR1與FPN1表達較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與體內(nèi)實驗的結果基本一致(圖2)。

圖2 PC-12細胞缺氧復氧后TF、TFR1、FPN1表達變化A.Western blot法檢測結果;B～D.分別為TF、TFR1、FPN1與內(nèi)參GADPH比值統(tǒng)計圖。與對照組比較，*P<0.05

3.TF處理后PC12活性氧情況比較：按照分組要求對細胞進行相應處理，收集細胞染色后行流式檢測發(fā)現(xiàn)，HR組較對照組ROS水平顯著上升，且差異有統(tǒng)計學意義；TF組與對照組ROS水平比較差異無統(tǒng)計學意義；HR+TF組與HR組比較，PC12中ROS水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義，可見給予TF重組蛋白可以顯著減輕PC12細胞中由缺氧復氧所致ROS水平升高(圖3)。

圖3 TF重組蛋白處理后PC12細胞ROS水平變化A.流式結果；B.各組DHE平均熒光強度。與對照組比較，*P<0.05；與HR組比較，#P<0.05

4.TF處理后PC12細胞凋亡情況比較：在對各組細胞行Tunel染色發(fā)現(xiàn)，對照組與TF組無明顯細胞凋亡；HR組較對照組細胞凋亡水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而HR+TF組較HR組細胞凋亡比率顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義。也就說明Transferrin能夠在一定程度上減輕由缺氧復氧所致的PC12神經(jīng)元細胞凋亡(圖4)。

圖4 TF重組蛋白處理后PC12細胞凋亡水平變化A.免疫熒光結果(Tuneil染色，400倍);B.各組細胞凋亡比例。與對照組比較，*P<0.05；與HR組比較，#P<0.05

討 論

隨著心臟外科技術與設備的不斷發(fā)展，體外循環(huán)輔助下的心臟外科手術成功率穩(wěn)步提升。但隨著患者的年齡逐漸增加，腦缺血再灌注損傷仍然是CPB的主要并發(fā)癥[3]。因此，研究腦缺血再灌中的具體機制及可能的干預靶點，對于CPB所致的腦缺血再灌注損傷的防治極為重要。Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)，短暫性前腦缺血(transient forebrain ischemia,TFI)后，鐵超載會導致氧自由基產(chǎn)生和海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元細胞延遲性死亡(delayed neuronal death，DND)。與此同時， Zhao等[7]通過體內(nèi)外模型研究證實，裝載番茄紅素的納米脂質體顆粒可以促進TF的表達，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵離子水平，抑制炎性細胞因子分泌，降低活性氧產(chǎn)生，進而保護神經(jīng)元細胞免受腦缺血再灌損傷。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥與腦損傷后鐵代謝也有諸多研究成果。葛等通過大鼠腦缺血模型發(fā)現(xiàn)，腦泰方可以降低腦出血所致神經(jīng)元細胞鐵超載水平，增加細胞抗氧化能力，減輕細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8]。與此同時，郭純等[9]研究發(fā)現(xiàn)，安腦平?jīng)_方可以通過下調(diào)細胞內(nèi)TF與TFR的表達，降低神經(jīng)元細胞內(nèi)鐵離子水平，防止鐵超載，進而起到腦出血后神經(jīng)保護作用?？梢婅F穩(wěn)態(tài)對于腦損傷相關疾病的發(fā)生、發(fā)展具有極其重要的作用。正常情況下，鐵穩(wěn)態(tài)受到鐵代謝相關蛋白的嚴密調(diào)控，因此鐵代謝調(diào)控相關蛋白極可能是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要節(jié)點。

鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關蛋白主要包括TF、TFR1、FPN1等。鐵離子主要經(jīng)由小腸吸收，在體內(nèi)通過與TF結合進行轉運，TF與細胞膜上的TFR1及TFR2結合，形成TF-TFR復合體，通過細胞膜內(nèi)吞作用進入到細胞內(nèi)，胞內(nèi)部分鐵離子維持參與細胞正常生理功能，部分鐵以鐵蛋白的形式貯存于細胞內(nèi)，進而參與到細胞正常的生理活動之中。鐵離子進入細胞后，經(jīng)由FPN1轉運出細胞，主要來源于肝臟的鐵調(diào)素可以調(diào)控FPN1的表達，進而實現(xiàn)鐵代謝的動態(tài)調(diào)控[4]。關于鐵代謝相關蛋白在缺血再灌注損傷中的表達及作用尚不明確，因此，本研究通過體內(nèi)、外實驗驗證在缺血再灌注環(huán)境下，鐵代謝相關蛋白的表達變化及其對缺血再灌注損傷所造成的影響。

本研究通過免疫組化檢測了參與鐵代謝相關蛋白的表達變化。可見TF在IR組表達較Sham組顯著增多。TFR1、FPN1表達在IR組較Sham組表達明顯降低。在體外實驗中，通過對PC12細胞系進行缺氧復氧發(fā)現(xiàn)TF、TFR1及FPN1表達變化與在體腦缺血再灌基本一致。鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控過程中，TF表達增多導致鐵轉運入細胞內(nèi)增多或FPN1的表達降低導致鐵轉出減弱，是否是所致神經(jīng)元細胞內(nèi)鐵超載主要原因需要進一步研究。有研究表明，空載的TF可以結合胞外游離Fe3+，降低氧化應激反應并有利于呼吸衰竭的恢復[10]。Fe3+自身氧化還原特性對于ROS的產(chǎn)生極為重要，ROS積聚會導致神經(jīng)元細胞氧化損傷。因此降低細胞外Fe3+濃度，減輕Fe3+的細胞氧化毒性對于神經(jīng)元細胞保護極為重要[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TF表達增高，推測其可能通過結合細胞外游離的Fe3+，降低胞外Fe3+的細胞毒性作用，進而對PC12細胞缺血再灌注損傷起到保護作用[12,13]。ROS水平升高與細胞凋亡增多是缺血再灌注損傷嚴重程度的主要指標，為了驗證TF在腦缺血再灌注損傷中的作用，筆者檢測各組PC12細胞內(nèi)ROS水平，通過Tunel檢測細胞凋亡比率發(fā)現(xiàn)，HR組細胞ROS水平及細胞凋亡水平較對照組顯著增高，HR組+TF組較HR組細胞活性氧水平顯著降低，細胞凋亡顯著減少?？梢娫赥ransferrin重組蛋白處理細胞后，其可能通過結合培養(yǎng)基中的Fe3+，降低胞外游離Fe3+的濃度，并在一定程度上降低缺氧復氧所致PC12內(nèi)的ROS水平，同時降低細胞凋亡率[14]。

綜上所述，空載TF可以通過降低胞外Fe3+濃度，減少ROS積聚減輕CPB后腦損傷，針對CPB后腦損傷高?；颊?，通過外源性輸注適量單位的TF或許對于CPB輔助心臟外科術后腦損傷的防治具有積極作用[15,16]。本研究通過體外細胞模型發(fā)現(xiàn)，在缺氧復氧條件下TF能降低PC12細胞系內(nèi)ROS水平，同時減少細胞凋亡，對于TF應用于CPB后腦損傷提供基礎研究依據(jù)。當然，本實驗也存在一些不足，主要是未在體外模型中研究TF對腦缺血再灌注損傷的效果進行評估。再者，未評估TF對于機體其他組織器官的正常功能是否有影響，這些也是后續(xù)研究的內(nèi)容[17,18]。