HRAS基因表達對宮頸癌細(xì)胞自噬及凋亡作用及機制

閻臻 付曉瑞 李新敏 崔珺

[摘要]目的 探討Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（HRAS）表達對宮頸癌細(xì)胞自噬及凋亡的作用及其機制。方法 構(gòu)建宮頸癌小鼠模型，蘇木精-伊紅（HE）染色驗證小鼠模型構(gòu)建是否成功。將宮頸癌Hela細(xì)胞分為4組，空白對照組（A組：不轉(zhuǎn)染任何序列）、陰性對照組（B組：轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒）、HRASvector組（C組：轉(zhuǎn)染HRAS過表達質(zhì)粒）、si-HRAS組（D組：轉(zhuǎn)染HRAS沉默質(zhì)粒siRNA）。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blot分別檢測宮頸癌組織和細(xì)胞中HRAS、磷酸酶和張力蛋白同源物基因（PTEN）、自噬相關(guān)基因7（ATG7）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、Beclin1、BCL2關(guān)聯(lián)X蛋白（bax）、TNF受體超家族成員6（Fas）和E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示宮頸癌小鼠造模成功。宮頸癌小鼠模型中HRAS呈高表達，PTEN表達下調(diào)（t=9.450～14.260，P<0.05）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HRASvector組HRAS、bcl-2 mRNA和蛋白表達水平明顯上升，PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin均呈低表達，細(xì)胞凋亡率明顯下降（F=1.011～220.400，P<0.05）;而si-HRAS組趨勢相反（F=3.160～622.800，P<0.05）。結(jié)論 HRAS基因表達下調(diào)可能通過激活PTEN信號通路促進小鼠宮頸癌細(xì)胞自噬和凋亡，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制宮頸癌的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]基因，ras;宮頸腫瘤;自噬性細(xì)胞死亡;細(xì)胞凋亡;PTEN信號通路

[中圖分類號]R394.2;R737.33

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0240-06

[ABSTRACT]Objective To investigate the role and mechanism of V-Ha-Ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog （HRAS） gene expression in the autophagy and apoptosis of cervical cancer cells.?Methods A mouse model of cervical cancer was established， and HE staining was used to verify whether this model was successfully established. Cervical cancer Hela cells were divided into blank control group （no transfection of any sequences）， negative control group （transfection with empty vector plasmid）， HRAS vector group （transfection with HRAS overexpression plasmid）， and si-HRAS group （transfection with HRAS-silencing plasmid siRNA）. Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of HRAS， phosphatase and tensin homolog （PTEN）， autophagy-related gene 7 （ATG7）， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）， Beclin1， Bcl2-associated X protein （bax）， tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 （Fas）， and E-cadherin in cervical cancer tissue and cells， and flow cytometry was used to observe apoptosis in each group. ?Results HE staining showed that the mouse model of cervical cancer was successfully established. HRAS was highly expressed and PTEN expression was downregulated in the mouse model of cervical cancer （t=9.450-14.260，P<0.05）. After transfection， the HRAS vector group had significant increases in the mRNA and protein expression of HRAS and Bcl-2， low expression of PTEN， ATG7， LC3， Beclin1， bax， Fas， and E-cadherin， and a significant reduction in cell apoptotic rate （F=1.011-220.400，P<0.05）， while the si-HRAS group showed opposite trends （F=3.160-622.800，P<0.05）.?Conclusion By activating the PTEN signaling pathway， downregulation of the HRAS gene may promote the autophagy and apoptosis of cervical cancer cells in mice， inhibit epithelial-mesenchymal transformation， and thus inhibit the development of cervical cancer.

[KEY WORDS]genes， ras; uterine cervical neoplasms; autophagic cell death; apoptosis; PTEN signaling pathway

宮頸癌是與乳癌具有相似病死率的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性生活質(zhì)量[1]。其目前可用治療方式（外科手術(shù)為主、放化療為輔）和治療效果均值得肯定[2-3]。然而，上述療法仍然存在一定的局限性，腫瘤復(fù)發(fā)率高、放化療毒副作用大[4]。目前的研究重點已轉(zhuǎn)向新型分子靶向藥物的研發(fā)[5]。國內(nèi)外相關(guān)研究認(rèn)為，腫瘤發(fā)展由多因素共同作用，其中遺傳學(xué)因素發(fā)揮重要作用[6-8]。在多種腫瘤中，RAS基因家族的基因突變使其激活，從而成為具有致癌活性的癌基因[9]。研究結(jié)果顯示，Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（HRAS）隸屬于RAS基因家族，在胃癌、乳癌中異常表達[10-11]。同時，PTEN基因為多種腫瘤抑制基因，其適度表達可促進細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[12-14]。本研究通過生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)HRAS和PTEN信號通路在宮頸癌中具有顯著作用，本文探究HRAS基因表達對宮頸癌細(xì)胞自噬及凋亡的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫，上海）;人宮頸癌標(biāo)本（鄭州市婦幼保健院手術(shù)切除標(biāo)本）;無特定病原體級雌性BALB/c小鼠（中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部，飼養(yǎng)于本院實驗室）;HRAS沉默質(zhì)粒（si-HRAS）、HRAS過表達質(zhì)粒（HRASvector）等質(zhì)粒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，北京百奧萊博科技有限公司）;PCR擴增引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）;實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（ABI公司，美國）;ABI 7500熒光定量PCR儀（北京京科瑞達科技有限公司）;RIPA細(xì)胞裂解液（上海圖赫實業(yè)有限公司）;Western blot檢測抗體（上海博谷生物科技有限公司）;BCA試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司）;ECL熒光檢測試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司）;Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇）;流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 宮頸癌小鼠模型的構(gòu)建及組織處理 取BALB/c小鼠，每5只合并一籠飼養(yǎng)，12 h-12 h晝夜交替光照，能自由獲取食物和水。采用數(shù)字表法將18只小鼠隨機分成3組：正常組（A組），假手術(shù)組（B組），模型組（C組），每組6只小鼠。在無菌操作條件下，將人宮頸癌新鮮腫瘤標(biāo)本經(jīng)處理清除壞死組織和血塊后，剪成約2 mm3的組織塊備用。將模型組小鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后固定于操作臺，腹部消毒，做長0.5 cm切口，將制備標(biāo)本植于腹部皮下。假手術(shù)組小鼠經(jīng)腹腔注射1 mL純生理鹽水。手術(shù)全程在無菌條件下完成。正常組小鼠不做任何處理。于超凈工作臺打開小鼠腹腔，直接用肉眼觀察荷瘤病灶形態(tài)。取模型組小鼠腫瘤組織分為兩部分：一部分用于蘇木精-伊紅（HE）染色;一部分在液氮中速凍，然后移至-70 ℃保存，用于后續(xù)檢測。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將宮頸癌Hela細(xì)胞分為4組，空白對照組（A組：不轉(zhuǎn)染任何序列）、陰性對照組（B組：轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒）、HRASvector組（C組：轉(zhuǎn)染HRAS過表達質(zhì)粒）、si-HRAS組（D組：轉(zhuǎn)染HRAS沉默質(zhì)粒siRNA）。將對數(shù)生長期Hela細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長至30%～50%融合時行轉(zhuǎn)染，室溫孵育后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下培養(yǎng)6～8 h后，換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h后，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測 取各組小鼠組織標(biāo)本以及各分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取組織和細(xì)胞中總RNA。組織水平上檢測HRAS和PTEN的表達量;細(xì)胞水平上檢測HRAS、PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin的表達量。取反應(yīng)液進行熒光定量PCR，采用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測。采用2-ΔΔCt計算mRNA表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測 轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞裂解后，離心棄除沉淀，取上清為細(xì)胞總蛋白。取上清液采用BCA試劑盒測定各樣品的蛋白濃度。滴加一抗兔多克隆抗體HRAS、PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bcl-2、bax、Fas和E-cadherin，4 ℃孵育過夜，次日加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗室溫下孵育。以化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進行曝光。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢查 采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞染色后凋亡變化。將各組細(xì)胞置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌后將細(xì)胞重懸，加入Annexin V-FITC和PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測細(xì)胞凋亡水平。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)用x2±s表示，多組間比較均采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌小鼠模型構(gòu)建

建模21 d后，小鼠全部成活，模型組小鼠均荷瘤成功，成瘤率為100%。肉眼觀察和HE染色結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組小鼠行動和外觀相對正常、無體質(zhì)量的明顯變化，均未見腫瘤病灶的形成，組織切面無異常變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整;模型組小鼠精神萎靡、行動遲緩、體質(zhì)量明顯下降，有半球形伴破潰和出血的腫瘤病灶形成，組織切面灰白、質(zhì)硬、血管豐富，癌細(xì)胞呈巢狀、胞核增大、核仁不明顯，表明建模成功。見圖1。

2.2 組織HRAS和PTEN的mRNA和蛋白表達

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組小鼠組織中的HRAS和PTEN的mRNA和蛋白表達量均無明顯差異（t=1.180～1.821，P>0.05）。與正常組相比較，模型組小鼠組織中HRAS mRNA和蛋白的表達量均顯著增加，PTEN mRNA和蛋白的表達量下降（t=9.450～14.260，P<0.05）。見圖2。

2.3 HRAS基因表達對PTEN信號通路的影響

qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，空白對照組HRAS mRNA和蛋白表達與陰性對照組比較差異無顯著性（t=0.186～1.088;均P>0.05）;與空白對照組和陰性對照組比較，HRASvector組HRAS的mRNA和蛋白表達水平明顯上升（F=19.600、23.270，P<0.05），PTEN的表達水平則明顯下降（F=16.760、35.130，P<0.05）。si-HRAS組HRAS的mRNA以及蛋白表達水平明顯下降（F=8.127、13.160，P<0.05），PTEN的表達水平明顯上升（F=9.456、22.940，P<0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

2.4 HRAS基因表達對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

qRT-PCR和Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子E-cadherin表達的結(jié)果顯示，E-cadherin的mRNA和蛋白表達在空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.069、0.686，P>0.05）;與空白對照組和陰性對照組比較，HRASvector組E-cadherin mRNA和蛋白表達水平明顯下降（F=4.220、8.110，P<0.05）。si-HRAS組E-cadherin蛋白表達水平明顯上升（F=12.600、18.280，P<0.05）。見圖4。

2.5 HRAS基因表達對細(xì)胞自噬的影響

qRT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)因子ATG7、LC3、Beclin1表達結(jié)果顯示，空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.130～0.470，P>0.05）;與空白對照組和陰性對照組比較，HRASvector組ATG7、LC3、Beclin1 mRNA和蛋白表達均明顯下降（F=2.742～7.310，P<0.05）。si-HRAS組ATG7、LC3、Beclin1 mRNA和蛋白表達明顯上升（F=3.160～30.970，P<0.05）。見圖4。

2.6 HRAS基因表達對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和凋亡率的影響

qRT-PCR和Western blot檢測bax、Fas、bcl-2結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.245～1.459，P>0.05）;與空白對照組和陰性對照組相比較，HRASvector組bax和Fas mRNA及蛋白表達水平明顯下降（F=1.011～7.314，P<0.05），bcl-2 mRNA和蛋白表達水平則明顯上升（F=177.300、220.400，P<0.05）。si-HRAS組bax及Fas mRNA和蛋白表達水平明顯上升（F=11.200～41.180，P<0.05），bcl-2 mRNA和蛋白表達則明顯下降（F=113.600、129.800，P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果表明，空白對照組和陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.020，P>0.05）。與空白對照組和陰性對照組相比較，HRASvector組細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.020，P<0.05）;si-HRAS組細(xì)胞凋亡則明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=622.800，P<0.05）。見圖4、5。

3 討 論

基因治療通過基因上調(diào)或沉默，介導(dǎo)特定作用通路，發(fā)揮對人類腫瘤的治療作用[15]。宮頸癌為女性常見婦科腫瘤之一，其發(fā)病率呈年輕化趨勢[16]。人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染已被證實為宮頸癌的主要誘因，且既往研究已證實HPV感染可通過刺激或抑制一系列復(fù)雜信號通路，進而誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞的瘤變或癌變[17-18]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是人類惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因之一，其可改變腫瘤細(xì)胞特性或腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，促進腫瘤生長、誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[19-20]。PTEN是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，已被證實在人類諸多癌癥中發(fā)生基因突變或高頻缺失，如生殖系統(tǒng)腫瘤、消化道腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤等[21-22]。PTEN可以調(diào)控多條信號通路，如PIK/AKT通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。例如，SONG等[23]就曾報道m(xù)icroRNA-126可通過靶向PIK3R2基因，進而調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。國內(nèi)亦有相似研究報道，如蔣立峰等[24]報道肺癌病人外周血Treg細(xì)胞計數(shù)明顯升高，且其機制可能與PTEN表達下調(diào)激活PI3K-AKT信號通路相關(guān);孫吉春等[25]發(fā)現(xiàn)抑制MiR-21表達可能通過調(diào)控PTEN/AKT信號通路抑制胰腺癌細(xì)胞AS-PC-1增殖和侵襲。目前，通過靶向激活PTEN信號通路從而促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進細(xì)胞增殖侵襲、自噬和凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為，已成為腫瘤基因治療的一新型熱點方向。

RNA干擾是通過關(guān)閉特定基因序列表達從而實現(xiàn)目標(biāo)基因表達沉默的過程?；虺聊诨蚬δ苎芯恳约瓣P(guān)聯(lián)信號通路的研究中發(fā)揮著重要作用，可用于探究腫瘤生長機制，為腫瘤的基因治療提供潛在的治療途徑[26]。鑒于此，本研究初步推測：HRAS基因沉默可能通過介導(dǎo)PTEN信號通路參與宮頸癌發(fā)病過程。

本文HE染色結(jié)果顯示，宮頸癌小鼠造模成功。造模后HRAS在宮頸癌小鼠中呈高表達，PTEN表達被抑制，過表達HRAS基因抑制PTEN表達，表明上調(diào)HRAS基因可能抑制PTEN信號通路的激活。同時，結(jié)合PCR、Western blot檢測細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、自噬和凋亡相關(guān)因子及凋亡率的結(jié)果表明，上調(diào)HRAS表達可導(dǎo)致bcl-2 mRNA和蛋白表達水平明顯上升，PTEN、ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin呈低表達，細(xì)胞凋亡率明顯下降;與此同時，低表達HRAS基因可激活PTEN信號通路活性，導(dǎo)致PTEN表達的上升，并下調(diào)bcl-2的表達，上調(diào)ATG7、LC3、Beclin1、bax、Fas和E-cadherin的表達，促進細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果說明，HRAS基因沉默可誘導(dǎo)PTEN信號通路的激活，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促進細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡。ATG7、LC3、Beclin1是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白[27];bax和Fas為促凋亡蛋白，而bcl-2為抑制凋亡蛋白[28]。細(xì)胞自噬為繼細(xì)胞凋亡的另一種細(xì)胞程序性死亡，其和細(xì)胞凋亡均在腫瘤細(xì)胞生存中扮演重要角色;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化同樣對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移意義重大。作者推測外源性HRAS基因沉默通過促進PTEN信號通路的激活，發(fā)揮PTEN抑制細(xì)胞增殖分裂、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及促腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng);誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白ATG7、LC3和Beclin1表達，促凋亡蛋白bax和Fas表達、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征性蛋白E-cadherin表達，并下調(diào)抑制凋亡蛋白bcl-2表達，提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞自噬和凋亡均參與了宮頸癌細(xì)胞死亡過程。本實驗結(jié)果符合既往研究有關(guān)HRAS基因表達和PTEN信號通路作用的報道。例如，SUN等[29]發(fā)現(xiàn)，HRAS異常甲基化誘導(dǎo)該促癌基因的激活可能是膀胱腫瘤發(fā)生的早期事件，并可能進一步作為膀胱組織腫瘤生物標(biāo)志物用于早期診斷和作為潛在的治療靶點。WU等[30]對吉西他濱在乳癌中的耐藥性進行研究，結(jié)果提示miR-21可通過PTEN/AKT信號通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其結(jié)果可用于預(yù)測最佳乳癌治療并為逆轉(zhuǎn)吉西他濱耐藥性提供潛在治療靶點。

總而言之，本研究顯示HRAS基因表達下調(diào)可促進PTEN信號通路的激活，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、小鼠宮頸癌細(xì)胞自噬和凋亡，從而抑制宮頸癌的發(fā)生。本研究結(jié)果有助于深入探究宮頸癌發(fā)生相關(guān)分子機制，從而為PTEN作為預(yù)防和改善宮頸癌治療方案潛在功能分子提供理論依據(jù)。然而，本文尚存在部分問題有待進一步研究，例如下調(diào)HRAS基因表達如何激活PTEN信號通路、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及自噬和凋亡等，HRAS基因表達下調(diào)介導(dǎo)PTEN信號通路激活在動物模型中的作用驗證，等等。這些問題均有助于我們更充分地理解HRAS基因表達通過PTEN信號通路介導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的作用機制，為該腫瘤的治療提供充分的理論證據(jù)。

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（本文編輯 于國藝）