骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平與鹿茸重量的相關(guān)性分析

趙佩,王洪亮,王磊,邢秀梅,胡鵬飛

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物重點(diǎn)試驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112)

鹿茸是自然界唯一能夠周期性完全再生的哺乳動(dòng)物骨質(zhì)附屬器官。除馴鹿雌、雄均生茸之外，只有雄鹿生茸，因此，鹿茸為鹿科動(dòng)物的第二性征[1]。鹿茸是一種可以周期性再生的骨質(zhì)器官，其成骨方式與典型的軟骨內(nèi)成骨類(lèi)似，但又有所不同。鹿茸軟骨是非常獨(dú)特的軟骨組織，它不僅在自然條件下能夠修復(fù)，而且每年以一種驚人的速度生長(zhǎng)(可達(dá)2 cm/d)[2]。鹿茸生長(zhǎng)頂端從遠(yuǎn)端到基部分為真皮組織、間充質(zhì)組織、前成軟骨組織、過(guò)渡組織和軟骨組織[3]。鹿茸生長(zhǎng)的本質(zhì)就是在軟骨骨架上的成骨過(guò)程，因此，鹿茸的生長(zhǎng)與骨發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。

MMP14是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中的成員。MMPs是指一系列在生理情況下可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶的家族總稱[4]。MMPs可分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)酶、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT-MMP)和其他5種亞型， MMP14屬于MT-MMP[5]。有研究表明MMPs在軟骨生長(zhǎng)及成熟中發(fā)揮著重要的作用，MMPs通過(guò)對(duì)ECM降解和重塑,促進(jìn)血管間充質(zhì)浸潤(rùn),保證了軟骨內(nèi)成骨的有序演進(jìn)，同時(shí)某些MMPs在骨的發(fā)育中還發(fā)揮著將膠原前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炷z原的作用[6-7]。MMPs尤其MMP14作為軟骨骨化的重要影響因子,受到了很大關(guān)注。Ⅰ型膠原α2基因(COL1A2)是編碼I型膠原蛋白的主要基因[8]。Ⅰ型膠原是骨基質(zhì)中含量最多的蛋白，占骨基質(zhì)有機(jī)物的80%～90%，構(gòu)成骨組織的蛋白框架，是鈣鹽沉著以及細(xì)胞附著的支架，其合成分泌是骨組織形成的先決條件，是成骨細(xì)胞分化最早的標(biāo)志[9]。COL11A1基因編碼Ⅺ型膠原α1鏈,Ⅺ型膠原蛋白是是軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在細(xì)胞外基質(zhì)中起重要的作用，Ⅺ型膠原參與其他軟骨特異性膠原(Ⅱ型和Ⅸ膠原)的纖維形成，并參與調(diào)節(jié)軟骨膠原纖維的直徑[10]。SPARC(secreted protein, acidic and rich in cysteine)，又稱作骨連接蛋白(osteonecfin)、基底膜40 蛋白(BM40)，是一種富含半胱氨酸(Cys)的酸性分泌蛋白，最早是從骨中分離出來(lái)的[11]。研究表明 SPARC 是一種成骨相關(guān)蛋白，與鈣離子有高度親和力，可以使得骨基質(zhì)進(jìn)一步鈣化，對(duì)于骨組織維持和重建是必需的[12]。PHOSPHO1(phospho ethanol amine/磷酸膽堿磷酸酶) 是磷酸脫氫酶家族的成員，參與無(wú)機(jī)磷酸鹽的生成，最初是從雞肥大生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中克隆出來(lái)的，在骨礦化中起到核心作用，PHOSPHO1通過(guò)其底物磷膽堿(PCHO)和磷乙醇胺(PEA)的水解釋放無(wú)機(jī)磷(PI)，用于骨骼礦化[13]。RHOA蛋白是一種23 kDa 的單體小G蛋白，由193個(gè)氨基酸組成,具有N端與C端2個(gè)結(jié)構(gòu)域[14-15],屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，為GTP家族中重要成員，是GTP酶之一，參與細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等多種生物體內(nèi)的生理過(guò)程[16]。CTNNB1基因全長(zhǎng)23.2 kb，有16個(gè)外顯子，編碼β-catenin蛋白，其編碼的β-catenin蛋白含781個(gè)氨基酸[17-18]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路被稱為Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典途徑[19]，在調(diào)控骨的形成與改建過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，調(diào)控骨組織中包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的分化、增殖，控制間充質(zhì)細(xì)胞凝聚、軟骨內(nèi)骨化作用啟動(dòng)等過(guò)程的調(diào)控[20-22]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于鹿茸生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)研究很多，鹿茸的快速生長(zhǎng)受到一系列相關(guān)分子的嚴(yán)格調(diào)控，在鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)，甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrp)、視黃酸(RA)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和骨形成蛋白(BMP)等起重要的調(diào)節(jié)作用。但目前關(guān)于鹿茸中與骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)用熒光定量PCR方法檢測(cè)不同重量鹿茸中與骨發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況，為鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

試驗(yàn)所需梅花鹿鹿茸為二杠茸，均采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所中心鹿場(chǎng)，依據(jù)同一鋸別、相同生長(zhǎng)天數(shù)、鹿茸重量不同，分為低重量和高重量?jī)山M，每組3個(gè)。參照 Li等[23]對(duì)赤鹿生長(zhǎng)頂端的分層方法，分別切取前軟骨層和軟骨層組織，液氮研磨為細(xì)粉，迅速轉(zhuǎn)移至液氮中凍存。

1.2 主要試劑及儀器

RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit、SYBR?PremixExTaqTMKit均購(gòu)自TaKaRa公司。 LightCycler?480熒光定量PCR儀。

1.3 總RNA的提取

按照TRIzol試劑的說(shuō)明提取組織總RNA,使用Nanodrop2000微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的OD值(260 nm吸光度值與280 nm吸光度值之比，反映核酸的純度)和濃度(ng/μL)，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)RNA的完整性。

1.4 cDNA合成

反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:RNA模板1 μL，OligodT1 μL，RNase Free ddH2O 11 μL，65 ℃加熱10 min后立即置于冰上冷卻，冰浴后離心數(shù)秒，向反應(yīng)管中繼續(xù)添加以下試劑：5×RT Buffer 4 μL, Inhibitor 0.5 μL, 10 × dNTP Mixture 2 μL,反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，在反應(yīng)管中將試劑小心混勻并輕度離心；反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)程序：55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，置于冰上終止反應(yīng)。全程操作在冰上進(jìn)行。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用持家基因GAPDH進(jìn)行PCR檢測(cè)。將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA產(chǎn)物于-20 ℃保存,以用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

以管家基因GAPDH為內(nèi)參[24]，用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。引物由上海生物工程股份有限公司合成。將引物用滅菌超純水溶解，稀釋為10 μmol/L，-20 ℃保存。

表1 熒光定量RT-PCR 目的基因引物的相關(guān)信息

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

分別擴(kuò)增MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因，檢測(cè)引物特異性。PCR反應(yīng)體系：總體積25 μL，其中cDNA模板1 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，0.5 U/μLTaqDNA聚合酶,上、下游引物各0.5 μL，滅菌去離子H2O 17.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。采用SYBR Green I熒光染料法對(duì)組織中MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析，PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，F(xiàn)astStar Essential DNA Green Master 10 μL, 上、下游引物各1 μL，RNase Free ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性10 s, 60 ℃退火10 s,72 ℃延伸20 s；循環(huán)40次后進(jìn)行溶解曲線分析：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，然后以每10 s上升1 ℃的速率從65 ℃升高到95 ℃。每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，計(jì)算目的基因與看家基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 生物信息學(xué)分析

利用STRING軟件對(duì)骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)互作進(jìn)行分析，同時(shí)應(yīng)用Cytoscape軟件制作骨發(fā)育相關(guān)基因參與生物學(xué)過(guò)程模式圖。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)不同重量鹿茸尖端組織骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)法分析骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平與鹿茸重量之間的相關(guān)性，所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組別鹿茸重量比較

不同組別鹿茸重量比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低重量組和高重量組鹿茸重量分別為(1.49±0.12)kg和(3.32±0.21)kg，存在極顯著差異(P<0.01)。

2.2 提取的樣品總RNA檢測(cè)

提取出的樣品總RNA在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

1～3. 高產(chǎn)組個(gè)體；4～6. 低產(chǎn)組個(gè)體

由圖1可以看到28S、18S RNA條帶明亮，且2條帶的亮度比值接近2∶1，表明所提取的總RNA完整性較好，濃度和純度可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.3 普通PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，通過(guò)普通PCR擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖2，GAPDH、MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC和CTNNB1基因的PCR產(chǎn)物電泳條帶顯示，引物擴(kuò)增目的條帶單一，大小與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)合理，同時(shí)cDNA未受到基因組DNA的污染，可以作為后續(xù)試驗(yàn)?zāi)０迨褂谩?/p>

M. DL500 Marker；1.GAPDH；2.MMP14；3.COL11A1；4.PHOSPHO1；5.RHOA；6.COL1A2；7.SPARC；8.CTNNB1

2.4 不同鹿茸重量組尖端組織生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量比較

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因進(jìn)行了表達(dá)量的測(cè)定，結(jié)果如圖3。高重量組MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC和CTNNB1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量都顯著高于低重量組(P<0.01或P<0.05)。

2.5 骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量與鹿茸重量的相關(guān)分析

骨發(fā)育基因表達(dá)水平與鹿茸重量的相關(guān)系數(shù)研究結(jié)果顯示，MMP14基因表達(dá)水平與鹿茸重量相關(guān)系數(shù)為0.947，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因表達(dá)水平與鹿茸重量相關(guān)系數(shù)依次為0.846、0.904、0.849、0.819、0.859、0.902，呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

2.6 鹿骨發(fā)育相關(guān)基因生物信息學(xué)分析

利用STRING工具查詢分析，結(jié)果如圖4所示，在動(dòng)物機(jī)體中MMP14、COL11A1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因之間可能存在相互作用關(guān)系。

注：SRP表示低重量組的間充質(zhì)層和前成軟骨層；LRP表示高重量組的間充質(zhì)層和前成軟骨層。*P<0.05，**P<0.01A. MMP14;B. COL11A1;C. RHOA;D. PHOSPHO1;E. COL1A2;F. SPARC;G. CTNNB1

圖4 骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)互作模式

利用生物信息學(xué)，初步研究COL11A1、COL1A2、MMP14、SPARC、RHOA、CTNNB1基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程。圖5表明：COL11A1主要參與胚胎骨骼發(fā)育、組織發(fā)育和軟骨內(nèi)骨化等生物學(xué)過(guò)程；COL1A2主要參與胚胎骨骼發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程；MMP14主要參與胚胎骨骼發(fā)育、骨骼發(fā)育、組織發(fā)育和軟骨內(nèi)骨化等生物學(xué)過(guò)程；SPARC主要參與胚胎骨骼發(fā)育、骨骼發(fā)育和軟骨內(nèi)骨化等生物學(xué)過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程；RHOA主要參與胚胎骨骼發(fā)育、骨骼發(fā)育、組織發(fā)育和軟骨內(nèi)骨化等生物學(xué)過(guò)程。CTNNB1主要參與胚胎骨骼發(fā)育。綜上，COL11A1、COL1A2、MMP14、SPARC、RHOA和CTNNB1共同參與生物機(jī)體的骨骼發(fā)育及軟骨內(nèi)骨化。

圖5 骨發(fā)育相關(guān)基因參與生物學(xué)過(guò)程模式圖

3 討論

本試驗(yàn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)不同重量鹿茸尖端組織中與骨發(fā)育相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。李劍[7]研究表明MMP14缺乏，可使成骨細(xì)胞無(wú)法參與軟骨骨化。另有證據(jù)表明MMP14缺失的鼠體中次級(jí)骨化中心的出現(xiàn)延遲[25]。這些研究表MMP14的低表達(dá)可能會(huì)造成軟骨細(xì)胞增殖受限，延遲軟骨骨化。本試驗(yàn)對(duì)比不同重量鹿茸中MMP14的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與鹿茸重量呈極顯著正相關(guān)，表明鹿茸中MMP14基因的高表達(dá)可能促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟骨化，進(jìn)而有利于鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

研究表明Ⅰ型膠原的表達(dá)與骨骼生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。Hikita等[26]研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原可以抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨。王艷雙等[27]對(duì)梅花鹿鹿茸Ⅰ型膠原對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原過(guò)表達(dá)可以抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、成熟。有研究表明加速Ⅰ型膠原合成分泌可以起到促進(jìn)骨組織礦化的作用[28-29]。這些研究表明Ⅰ型膠原高表達(dá)可以抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟分化。本試驗(yàn)對(duì)比不同重量鹿茸中COL1A2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在高重量鹿茸中表達(dá)量要顯著高于低重量組，且表達(dá)量與鹿茸重量呈顯著正相關(guān)，表明鹿茸中COL1A2基因的高表達(dá)可能促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟骨化，進(jìn)而促進(jìn)鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

Emma等[30]研究報(bào)道COL11A1基因 mRNA 的合成和穩(wěn)定性降低可能會(huì)引發(fā)骨軟骨疾病。Ⅺ型膠原蛋白的低表達(dá)會(huì)抑制軟骨細(xì)胞的分化、成熟，造成軟骨發(fā)育不健全。本試驗(yàn)對(duì)比不同重量鹿茸中COL11A1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在高重量鹿茸中表達(dá)量要顯著高于低重量，且表達(dá)量與鹿茸重量呈顯著正相關(guān)，表明鹿茸中CO11A1基因的高表達(dá)可能促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟骨化，進(jìn)而增大生長(zhǎng)期鹿茸的重量。

研究表明，RHOA/ROCK 信號(hào)通路通過(guò)改變細(xì)胞骨架，進(jìn)一步影響成骨分[31]。Takeshita等[32]在鼠的關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn) RHOA/ROCK 信號(hào)通路可以改變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞骨架，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變。本試驗(yàn)對(duì)比不同重量鹿茸中RHOA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)高重量鹿茸中表達(dá)量要顯著高于低重量，且表達(dá)量與鹿茸重量呈顯著正相關(guān)，表明鹿茸中RHOA基因的高表達(dá)可能會(huì)改變軟骨細(xì)胞骨架，利于成骨細(xì)胞成熟骨化，增加鹿茸重量。

有證據(jù)表明PHOSPHO1特異性表達(dá)于骨和軟骨的礦化部位，在成骨細(xì)胞系中高度表達(dá)，其產(chǎn)生礦化基質(zhì)，有助于骨骼的礦化[13]。Macrae等[33]研究發(fā)現(xiàn)非PHOSPHO1小雞的骨骼礦化受到顯著抑制，不利于長(zhǎng)骨的形成，說(shuō)明PHOSPHO1的低表達(dá)抑制成骨細(xì)胞的成熟、骨化。本試驗(yàn)對(duì)比不同重量鹿茸中PHOSPHO1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在高重量鹿茸中表達(dá)量要顯著高于低重量，且表達(dá)量與鹿茸重量呈顯著正相關(guān)，表明鹿茸中PHOSPHO1基因的高表達(dá)可能促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟骨化，以促進(jìn)鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

有研究表明，SPARC會(huì)使骨生成增加，脂肪生成減少[34]。Sharma等[35]研究發(fā)現(xiàn)非SPARC小鼠成骨能力顯著下降主要表現(xiàn)為成骨細(xì)胞數(shù)目減少，進(jìn)而骨軟化，提示SPARC在維持成骨細(xì)胞增殖過(guò)程中起重要作用。張然然等[36]研究發(fā)現(xiàn)SPARC在鹿茸的快速生長(zhǎng)與快速骨化過(guò)程中起著重要的作用。這些研究表明SPARC低表達(dá)會(huì)抑制成骨細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致成骨作用減弱，進(jìn)而出現(xiàn)骨軟化。本試驗(yàn)對(duì)比不同重量鹿茸中SPARC的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在高重量鹿茸中表達(dá)量要顯著高于低重量，且表達(dá)量與鹿茸重量呈顯著正相關(guān)，表明鹿茸中SPARC基因的高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，進(jìn)而加速鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

WNT信號(hào)通路調(diào)控著成骨細(xì)胞分化并且在已分化的成骨細(xì)胞中調(diào)控著骨形成。Glass等[37]研究表明，在已分化成骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的beta-catenin信號(hào)，引起骨量的增加，而其表達(dá)信號(hào)的降低導(dǎo)致骨量減少。Mount等[38]對(duì)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行研究，β-catenin通過(guò)Wnt信號(hào)通路在調(diào)節(jié)鹿角祖原細(xì)胞存活及凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并且對(duì)骨形成具有一定調(diào)節(jié)作用。這些研究表明高表達(dá)的CTNNB1會(huì)促進(jìn)成骨作用。本試驗(yàn)對(duì)比不同重量鹿茸中CTNNB1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在高重量鹿茸中表達(dá)量要顯著高于低重量，且表達(dá)量與鹿茸重量呈顯著正相關(guān)，表明鹿茸中CTNNB1基因的高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，加強(qiáng)鹿茸成骨作用，增加鹿茸的重量。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)比較高低重量組鹿茸尖端骨發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因的表達(dá)存在顯著差異，且骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)與鹿茸重量呈顯著正相關(guān)。據(jù)此推測(cè)，骨發(fā)育相關(guān)基因的高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化、成熟，加速鹿茸骨化，以形成結(jié)實(shí)的密質(zhì)骨，從而使鹿茸角重量增加。