1株鴨源污染棒狀桿菌的分離鑒定與致病性分析

李超，張若楠，李海賓，馮政，王希玉，仲艷，秦濤,3，陳素娟,3，彭大新,3,4*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省家禽疫病防控工程技術(shù)研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4.江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

棒狀桿菌是革蘭陽性菌，多為人類皮膚和黏膜的正常菌群，一般無致病性，只有當(dāng)它轉(zhuǎn)移至非正常寄居部位或機(jī)體抵抗力下降、外傷經(jīng)傷口感染時才引起機(jī)體感染[1]。但近年來，對于棒狀桿菌的感染報道越來越多，逐漸引起重視，如可從人的關(guān)節(jié)[2]、生殖道[2]、火雞的尾脂腺、牛和嚙齒類動物[3-5]中分離到致病性棒狀桿菌。某些棒狀桿菌可以造成羊、牛等動物的淋巴結(jié)腫大以及內(nèi)臟的出血和化膿癥狀[6-7]。禽類中也有少量報道，如路振香等[8]和王振忠等[9]分別從雞和鴨中分離到棒狀桿菌，但致病性未知。

棒狀桿菌生物學(xué)分型包含假白喉棒狀桿菌、白喉棒狀桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌、干燥棒狀桿菌、微小棒狀桿菌、類酵母棒狀桿菌及紋帶棒狀桿菌等[9]。污染棒狀桿菌(Corynebacteriumpollutisoli)是由Vivek等[10]于2016年從印度某垃圾場采集的土壤樣本中首先分離到。最近有報道，污染棒狀桿菌在堿性發(fā)酵及污水處理方面的潛在應(yīng)用價值[11-13]。但到目前為止，尚未在動物體中分離到污染棒狀桿菌。本研究從1例皮膚損傷的肉鴨中分離鑒定出污染棒狀桿菌，并對其致病性進(jìn)行初步分析，為臨床診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例背景

2020年4月，江蘇某櫻桃谷肉鴨屠宰加工場屠宰38～42日齡肉鴨發(fā)現(xiàn)皮膚損傷的比例偏高，低的約為3%～5%，高的可達(dá)70%～80%。收集原養(yǎng)殖場中有皮膚損傷的鴨進(jìn)行病原分離。

1.2 材料

綿羊血瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基自行配制；細(xì)菌生化管和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，批號分別為20190125和S1028；2日齡的健康雛鴨，購自泰興麗佳農(nóng)牧股份有限公司。

1.3 病原的分離鑒定

將病死鴨進(jìn)行剖檢、觀察，拍照記錄。無菌采集臟器，對鴨常見病毒病的病原如細(xì)小病毒[14]、圓環(huán)病毒[15]進(jìn)行PCR檢測和黃病毒[16]進(jìn)行RT-PCR檢測；對肝臟進(jìn)行表面消毒后，無菌接種環(huán)沾取病料，三區(qū)劃線接種于無菌脫纖維綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，挑取疑似菌落純化培養(yǎng)。

1.4 革蘭染色和鏡檢

挑取純化培養(yǎng)后的單個疑似菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

1.5 細(xì)菌鑒定

將細(xì)菌煮沸裂解，制備其 DNA 模板，參照 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 方法進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。PCR所用棒狀桿菌屬保守rpoB基因[11]的引物序列見表1。

表1 PCR引物

PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。rpoB基因擴(kuò)增的退火溫度為60 ℃，其他條件同上。

1.6 生化試驗

無菌操作將純化的細(xì)菌接種于細(xì)菌微量生化鑒定管，放入恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果。

1.7 藥敏試驗

將細(xì)菌接種至LB瓊脂培養(yǎng)基，按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會2005年推薦的 K-B 紙片法的要求進(jìn)行藥敏試驗并對結(jié)果進(jìn)行判定[17]。

1.8 致病性試驗

將分離到的菌株接種于血瓊脂，37 ℃培養(yǎng)10 h。用麥?zhǔn)媳葷岱y定菌液濃度，將 36只2日齡雛鴨，隨機(jī)分為 9組，每組4只，1、2兩組為腹腔接種， 3、4兩組為皮下接種，5、6兩組為劃痕接種，接種量分別為1.1×108和1.1×109CFU/mL細(xì)菌懸液 0.5 mL，同時設(shè)健康對照組，注射同等劑量的15%甘油PBS。連續(xù)觀察14 d，并記錄感染鴨發(fā)病死亡情況。如出現(xiàn)死亡則立即解剖，未死亡鴨撲殺后解剖，無菌采集肝臟、肺等組織，分離病原，進(jìn)一步鑒定。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病變

剖檢病鴨，肉眼可觀察到肺邊緣有散在的出血點；肝臟土黃色，壞死腫大；胰腺腫大；皮膚局部有紅點或融合成疹塊(圖1)。

2.2 分離培養(yǎng)

組織樣品接種培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取單個菌落純化，再培養(yǎng)16 h觀察菌落形態(tài)，血平板表面可見淡黃色透明光滑菌落，不溶血；LB瓊脂培養(yǎng)基上可見淡黃色透明光滑菌落。組織樣品中未檢測到細(xì)小病毒、黃病毒、圓環(huán)病毒。

A.肺臟上有出血點；B.肝臟腫大，呈土黃色；C.胰腺腫大；D.皮膚損傷

2.3 革蘭染色鏡檢

細(xì)菌革蘭染色結(jié)果顯示，分離菌為革蘭陽性菌，可見一端或兩端膨大，大多為桿狀，部分成“八字形”。

2.4 生化鑒定

該菌能發(fā)酵葡萄糖，不能發(fā)酵山梨醇、棉子糖、木糖、蔗糖；葡磷胨水(MR、VP)試驗、硫化氫、鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸、靛基質(zhì)、枸櫞酸鈉為陰性。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》可知，該菌與棒狀桿菌屬部分細(xì)菌的生化特性相似。

2.5 16S rDNA 基因擴(kuò)增及序列分析

16S rDNA基因擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示，在1 500 bp左右有一明顯條帶(圖2) 。將測定的16S rDNA基因序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)進(jìn)行BLAST搜索比對，與棒狀桿菌屬的成員相似性最高。與26株棒狀桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA 基因序列的同源性在94%～100%之間(圖3)，其中與棒狀桿菌(Corynebacteriumpollutisoli)VDS11TNR_151947.1的同源性為100%。分離株命名為污染棒狀桿菌JS01。

M. 2000 bp Marker；1. 分離菌

圖3 16S rDNA基因序列同源性分析

2.6 藥敏試驗

在測定的19種常見藥物中，JS01分離株對頭孢氨芐、慶大霉素、阿米卡星等5種藥物敏感，對青霉素、羧芐青霉素、諾氟沙星等13種耐藥，多重耐藥率為87.5%,耐藥情況嚴(yán)重。具體結(jié)果見表2 。

表2 JS01分離菌的耐藥性測定

2.7 致病性試驗

JS01株5.5×108CFU劑量腹腔接種組雛鴨于攻菌后第2、4、5天各死亡1只，5.5×107CFU劑量組第4天死亡1只，對照組在2周內(nèi)未見發(fā)病。剖檢死亡雛鴨發(fā)現(xiàn)，肝臟明顯腫大、肺臟出血、其他臟器病變不明顯。從死亡雛鴨的肝臟和肺臟再次分離病原并經(jīng)PCR鑒定為污染棒狀桿菌(圖4)。JS01株皮下接種雛鴨未見發(fā)病。劃痕接種5.5×108CFU劑量組在攻菌后第2、3天各2只雛鴨出現(xiàn)皮膚損傷，5.5×107CFU劑量組第3、7、14天各1只雛鴨出現(xiàn)皮膚損傷，但未見死亡；14 d后剖檢攻菌組雛鴨發(fā)現(xiàn)肝臟、肺臟出血，其他臟器病變不明顯，從雛鴨的肝臟和肺臟和損傷皮膚中再次分離病原并經(jīng)PCR鑒定為污染棒狀桿菌(圖4)。對照組2周內(nèi)未見發(fā)病。JS01株感染雛鴨后的死亡率見表3。

表3 JS01株感染雛鴨的致死情況

M. 2000bp Marker；1.腹腔接種鴨肝臟；2.腹腔接種鴨肺臟；3.劃痕接種鴨肝臟；4.劃痕接種鴨肺臟;5.劃痕接種鴨皮膚;6.陽性對照;7.陰性對照

3 討論

棒狀桿菌為需氧、無芽孢、有特殊排列規(guī)則的革蘭陽性桿菌，多數(shù)是人類皮膚和黏膜的正常菌群，一般被視為條件致病菌。但近年來，已經(jīng)成為一個世界性公共衛(wèi)生問題[18]。隨著人群老齡化、器官移植的開展、免疫抑制劑的大量使用，以及各種社會因素的影響，從上呼吸道感染、肺部感染、血液中棒狀桿菌的分離率逐漸升高[19]，尤以紋帶棒狀桿菌的分離率最高[20-22]。

本研究從皮膚損傷的肉鴨體內(nèi)分離到了污染棒狀桿菌，通過細(xì)菌形態(tài)觀察及生化試驗結(jié)果顯示，該菌在血瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)淡黃色光滑菌落，革蘭染色陽性的呈球狀、球桿狀或棒狀桿菌，與王斌等[23]分離的偽結(jié)核棒狀桿菌結(jié)果一致。本研究感染試驗中，分離菌5.5×108CFU經(jīng)腹腔接種2日齡健康雛鴨可致75%雛鴨死亡，而田雪等[24]分離的棒狀桿菌以最高劑量1.0×109CFU攻毒7日齡肉鴨，對肉鴨沒有致病作用，與我們的結(jié)果有所差異，分析可能與不同血清型菌株的致病能力以及所選攻毒動物的日齡有關(guān)。致死雛鴨剖檢結(jié)果顯示其肝臟腫大呈土黃色、肺臟出血，這與王振忠等[9]和黃麗麗等[25]所分離棒狀桿菌動物的病理圖片大致一致。本研究發(fā)現(xiàn)，劃痕接種5.5×108CFU劑量組100%出現(xiàn)皮膚損傷，5.5×107CFU劑量組雛75%出現(xiàn)皮膚損傷。藥敏試驗結(jié)果表明該菌具有多重耐藥性，多重耐藥率高達(dá)87.5%，可能與該養(yǎng)殖場抗生素的使用有關(guān)，濫用抗生素會導(dǎo)致各類細(xì)菌的耐藥性增加。

本文首次報道了棒狀桿菌感染動物的病例。究其原因，與養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)環(huán)境不佳有關(guān)，可導(dǎo)致鴨的非特異性抵抗力下降；再加上該病原廣泛存在于自然界中，這也是鴨體感染的可能原因之一。

綜上，本研究從病死的鴨體內(nèi)成功分離到1株污染棒狀桿菌；該菌對大多數(shù)抗生素藥物耐藥，耐藥譜廣。該菌感染既可造成雛鴨死亡，也可導(dǎo)致皮膚損傷。