當(dāng)歸拈痛湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效和作用機(jī)制的小鼠實(shí)驗(yàn)研究

陳紹華 ，王沁筠 ，吳昌桂 ，趙嘯 ，徐浩 ，施杞 ，梁倩倩 *

本研究背景：

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（AGA）并非單一因素致病，多數(shù)AGA患者采用常規(guī)對(duì)癥治療效果不理想且不良反應(yīng)較多。中藥復(fù)方以多成分、多靶點(diǎn)作用而在降尿酸、緩解AGA癥狀等方面具有獨(dú)特療效，但具體作用機(jī)制尚不完全明確。

本研究創(chuàng)新性：

本研究首次應(yīng)用C57BL/6雄性小鼠足掌深層跖跗關(guān)節(jié)周圍注射尿酸單鈉（MSU）誘導(dǎo)的AGA動(dòng)物模型而探究當(dāng)歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機(jī)制，初步證實(shí)當(dāng)歸拈痛湯可通過多方面作用（抗炎、調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)、降尿酸）治療AGA，是能夠解決AGA多個(gè)核心問題的有效方劑且安全性較高。

本研究局限性：

本研究為小鼠實(shí)驗(yàn)，由于目前尚無穩(wěn)定的高尿酸血癥小鼠模型，因此尚不能預(yù)估當(dāng)歸拈痛湯對(duì)血尿酸的長(zhǎng)期控制效果，臨床推廣尚需進(jìn)行倫理學(xué)審核及大樣本量隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

發(fā)生于第一跖趾關(guān)節(jié)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是痛風(fēng)的首要臨床表現(xiàn)，男性多發(fā)［1-2］，通常表現(xiàn)為劇烈疼痛伴紅腫［3］，呈急性發(fā)作性，并會(huì)逐步進(jìn)展為慢性［4-5］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前全球痛風(fēng)患病率為0.1%～10.0%［6］；我國(guó)男性痛風(fēng)患病率為1.20%～2.60%，女性痛風(fēng)患病率為0.01%～0.72%［7-11］，近年來我國(guó)痛風(fēng)患病率呈逐年升高趨勢(shì)。

AGA的發(fā)生發(fā)展主要涉及以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：（1）機(jī)體尿酸排泄不足引發(fā)高尿酸血癥［12-13］，同時(shí)體內(nèi)濃度較高的尿酸導(dǎo)致尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍沉積；（2）沉積的MSU晶體與駐留的巨噬細(xì)胞相互作用而導(dǎo)致NLRP3炎性小體形成、激活；（3）活化的NLRP3炎性小體通過募集胱天蛋白酶1而將促白介素1β加工為成熟的白介素1β（IL-1β）［14］，進(jìn)而通過活化中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞放大炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致一系列炎性因子、趨化因子釋放［15］。

對(duì)于AGA，若處理不當(dāng)則可能導(dǎo)致不可逆性組織破壞、骨侵蝕，最終造成關(guān)節(jié)疼痛、僵硬［2］。目前，臨床治療AGA要求盡快開始消炎止痛、終止急性發(fā)作［16］，推薦的治療方案是應(yīng)用非甾體抗炎藥、秋水仙堿及糖皮質(zhì)激素［17］，但上述藥物治療作用單一、長(zhǎng)期服用不良反應(yīng)較大，同時(shí)AGA的發(fā)生是多種因素作用的結(jié)果而非由單一因素所致［1-2］，因此消炎止痛并非AGA的最佳治療方案。對(duì)于AGA的治療，不僅要終止急性炎癥發(fā)作，還要對(duì)尿酸進(jìn)行有效管理并清除沉積的MSU結(jié)晶。中藥復(fù)方當(dāng)歸拈痛湯是臨床治療濕熱蘊(yùn)結(jié)型AGA的常用方劑，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究為小鼠實(shí)驗(yàn)，旨在探討當(dāng)歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機(jī)制，以期為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)于2020-08-17至2020-10-07實(shí)施。2020年8月，筆者所在課題組從上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入30只10～12周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為20～27 g，平均體質(zhì)量為（24±3）g；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0004；飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房并保證充足的食物和潔凈的水。本研究通過上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物、試劑、儀器

1.2.1 藥物 當(dāng)歸拈痛湯由羌活15 g、茵陳15 g、豬苓9 g、澤瀉9 g、黃芩3 g、苦參6 g、防風(fēng)9 g、升麻3 g、葛根6 g、白術(shù)3 g、蒼術(shù)6 g、黨參6 g、當(dāng)歸9 g、知母9 g、（炙）甘草15 g組成，均購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。0.9%氯化鈉溶液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H34023609，批號(hào)：20010808S，規(guī)格：500 ml）購(gòu)自上海市長(zhǎng)寧區(qū)天山中醫(yī)醫(yī)院藥房。

1.2.2 試劑 MSU晶體（Sigma，貨號(hào)：U2875-25G）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（Servicebio，貨號(hào)：G0002-2L）；尿酸檢測(cè)試劑盒（微板法）（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)：C012-2-1）；異氟烷（沃瑞德，貨號(hào)：Batch NO.217140901，規(guī)格：100 ml）；8分鐘RNA快速提取試劑盒（EZBioscience，貨號(hào)：B0004DP），帶gDNA Remover的彩色反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EZBioscience，貨號(hào)：A0010CGQ），ROX2 plus彩色實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒（EZBioscience，貨號(hào)：A0012-R2）。特定基因引物購(gòu)自華大基因，其中β-actin基因正向引物序列為5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'，反向引物序列為5'-TAGGAGCCAGAGCAGTAATC-3'；IL-1β基因正向引物序列為5'-CTGGTACATCAGCACCTCAC-3'，反向引物序列為5'-AGAAACAGTCCAGCCCATAC-3'；腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因正向引物序列為5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3'， 反 向 引 物序 列 為5'-GAGGTTGACTTTCTCCTGGTAT-3'； 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）基因正向引物序列為5'-AACGGAGAACGTTGGATTTG-3'，反向引物序列為5'-CAGCACAAGGGGTTTTCTTC-3'。

1.2.3 儀器 Bio Tek Cytation3細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)，Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀，Denovix DS-11超微量紫外可見分光光度計(jì)，Thermal cycler block 5020PCR熱循環(huán)儀，Matrx小動(dòng)物專用吸入麻醉機(jī)，JY88-IIN-超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；Shangping FA1004N電子天平，美耐特高精度電子數(shù)字顯示游標(biāo)卡尺，Hamilton 80600微升注射器（100 μl），1 ml無菌注射器（精度10 μl）和灌胃針，Eppendorf微量移液器，Costar96孔酶標(biāo)板及Bio-Rad 96孔qPCR板等。

1.3 方法

1.3.1 藥劑制備方法 按照常規(guī)體質(zhì)量對(duì)小鼠（25 g）與人（60 kg）中藥劑量進(jìn)行換算（換算系數(shù)為9.01），則小鼠需服中藥煎劑濃度為2.56 g/ml。取上述中藥1劑，加12倍水浸泡30 min后煮沸，煮沸后繼續(xù)煎煮30 min，趁熱過濾獲得煎液1；所余藥渣加8倍水，采用同樣的煮沸方法而獲得煎液2；合并兩次煎液并置于通風(fēng)櫥中加熱、濃縮至48 ml即為當(dāng)歸拈痛湯中藥液，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 動(dòng)物分組及AGA小鼠模型建立方法 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將30只小鼠編號(hào)并采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、溶劑組和DGNTT組，每組10只。稱取MSU晶體30 mg，溶于1.0 ml PBS并置于1.5 ml 微型離心管（EP管）中，充分震蕩后使用JY88-IIN-超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（強(qiáng)度25%、運(yùn)行5 s停10 s）粉碎1 min，使其變?yōu)榫鶆虻娜榘咨玀SU懸液（濃度為3%）。使用Hamilton 80600微升注射器在溶劑組和DGNTT組小鼠在雙側(cè)足掌深層跖跗關(guān)節(jié)周圍注射MSU懸液，20 μl/次，隔日1次，共注射3次誘導(dǎo)造模；對(duì)照組小鼠在雙側(cè)足掌深層跖跗關(guān)節(jié)周圍注射PBS，20 μl/次，隔日1次，共注射3次。

1.3.3 治療方法 三組小鼠于造模完成后同時(shí)開始給藥，其中對(duì)照組和溶劑組小鼠予以0.9%氯化鈉溶液灌胃，DGNTT組小鼠予以當(dāng)歸拈痛湯中藥液灌胃，均為0.2 ml/次，1次/d；三組小鼠均連續(xù)灌胃1周。

1.4 觀察指標(biāo) （1）體質(zhì)量：分別于治療前后測(cè)量三組小鼠體質(zhì)量；（2）足掌厚度增長(zhǎng)百分比：注射MSU懸液后6 h通常為AGA小鼠炎性腫脹達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)［18］，因此分別于造模前、造模后6 h、治療后1～7 d固定時(shí)間點(diǎn)（每日上午10點(diǎn)）采用美耐特高精度電子數(shù)字顯示游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠足掌厚度以計(jì)算足掌厚度增長(zhǎng)百分比，注意選取小鼠足爪腫脹最甚處；（3）IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量：治療后7 d取三組小鼠注射足部組織，去皮后采用磁珠研磨，先采用8分鐘RNA快速提取試劑盒提取mRNA，再采用ROX2 plus彩色qPCR試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次取平均值，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；（4）血尿酸濃度：治療后7 d摘取三組小鼠眼球并采血約1 ml，靜置2 h后采用高速冷凍離心機(jī)離心（3 000 r/min、4 ℃）15 min，吸取上層淡黃色血清300～400 μl至新的EP管中并做好標(biāo)記，放置于-80 ℃冰箱保存，采用尿酸檢測(cè)試劑盒（微板法）、酶比色法檢測(cè)血尿酸濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖的制作采用Graphpad Prism 8.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量 三組小鼠治療前體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.988，P=0.386），具有可比性；三組小鼠治療后體質(zhì)量比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.534，P=0.592）。三組小鼠治療后體質(zhì)量與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t配對(duì)值分別為1.84、1.163、0.714，P值分別為0.10、0.275、0.495），見圖1。

圖1 三組小鼠治療前后體質(zhì)量比較Figure 1 Comparison of body weight in the three groups of mice before and after treatment

2.2 足掌厚度增長(zhǎng)百分比 時(shí)間與方法在足掌厚度增長(zhǎng)百分比上存在交互作用（F交互=49.83，P交互＜0.001）；時(shí)間、方法在足掌厚度增長(zhǎng)百分比上主效應(yīng)顯著（F時(shí)間=218.58、P時(shí)間＜0.001，F(xiàn)方法=332.79、P方法＜0.001）。三組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長(zhǎng)百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為 254.53、149.54、113.83、248.63、83.67、239.79、94.85、195.98，P＜0.001）；溶劑組和DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長(zhǎng)百分比大于對(duì)照組，DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～5 d、7 d足掌厚度增長(zhǎng)百分比小于溶劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2～3。

圖2 三組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長(zhǎng)百分比比較Figure 2 Comparison of increased percentage of hind paws thickness in the three groups of mice 6 hours after modeling and 1 to 7 days after treatment

圖3 三組小鼠造模后6 h及治療后7 d足爪腫脹的典型圖片F(xiàn)igure 3 Typical pictures of hind paw swelling 6 hours after modeling and 7 days after treatment in the three groups of mice

2.3 IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量 三組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為55.97、341.63、340.88，P＜0.001）；溶劑組和DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.01），DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量低于溶劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

圖4 三組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Figure 4 Comparison of relative mRNA expression quantities of IL-1β，TNF-α and iNOS in the injected hind paw tissues in the three groups of mice 7 days after treatment

2.4 血尿酸濃度 三組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.11，P=0.002）；DGNTT組小鼠治療后7 d血尿酸濃度低于對(duì)照組、溶劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.001、0.003），而對(duì)照組與溶劑組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.154），見圖5。

圖5 三組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較Figure 5 Comparison of serum uric acid concentration in the three groups of mice 7 days after treatment

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，AGA屬“痹證”范疇，又稱“歷節(jié)”或“白虎歷節(jié)”，其病因病機(jī)為先天稟賦不足，或后天調(diào)攝不慎、飲食不節(jié)、恣飲瓊漿或嗜肥甘無度，或傷于情志飲食致使脾胃功能失調(diào)、腎精損傷，加之外感風(fēng)、寒、濕三氣而為?。籄GA急性發(fā)作期以濕熱蘊(yùn)結(jié)型為主［19-20］。當(dāng)歸拈痛湯源自《醫(yī)學(xué)啟源》，是清熱利濕、疏風(fēng)清熱的代表方，“治濕熱為病，肢節(jié)煩痛……遍身疼，下注于脛，腫痛不可忍”，方中羌活勝濕透關(guān)利節(jié)、防風(fēng)溫散經(jīng)絡(luò)中濕邪為君藥；升麻、葛根引陰中之陽上行而升散，白術(shù)和中除濕，蒼術(shù)去皮膚腠理之濕，為臣藥；當(dāng)歸活血散瘀止痛，黨參、（炙）甘草補(bǔ)脾益氣護(hù)胃，苦參、黃芩、知母、茵陳泄?jié)駸?、除肢?jié)煩痛，豬苓、澤瀉滲濕化飲，共為佐藥；（炙）甘草兼調(diào)和諸藥而為使。臨床研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸拈痛湯是治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)型AGA的驗(yàn)方，可有效減輕急性炎性反應(yīng)，療效與塞來昔布、秋水仙堿相當(dāng)［21-22］。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，澤瀉能降低大鼠血尿酸濃度，其作用機(jī)制可能與抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）活性、減輕腎臟損傷、下調(diào)腎臟中腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1的表達(dá)有關(guān)［23］；葛根有效成分葛根素不僅可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、炎性因子、信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎作用，還可通過抑制XOD活性、促進(jìn)尿酸排泄而降低血尿酸濃度，具有抗AGA作用［24］；黃芩有效成分黃芩苷可有效抑制大鼠的XOD活性［25］。

目前，MSU混懸液局部注射誘導(dǎo)是研究AGA最常用的動(dòng)物造模方法［26］，大鼠、雞、家兔是研究AGA最常用的造模動(dòng)物。為尋找更為經(jīng)濟(jì)和理想的AGA動(dòng)物模型，筆者所在課題組結(jié)合國(guó)外文獻(xiàn)［18，27］而嘗試建立了C57BL/6雄性小鼠足掌深層跖跗關(guān)節(jié)周圍注射MSU混懸液誘導(dǎo)的AGA動(dòng)物模型，并已證實(shí)其外在體征、發(fā)病機(jī)制、病理改變等與人AGA相似［28］。本研究首次應(yīng)用上述模型探究當(dāng)歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機(jī)制，結(jié)果顯示：溶劑組和DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長(zhǎng)百分比大于對(duì)照組，DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～5 d、7 d足掌厚度增長(zhǎng)百分比小于溶劑組，溶劑組和DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量低于溶劑組，DGNTT組小鼠治療后7 d血尿酸濃度低于對(duì)照組、溶劑組，表明當(dāng)歸拈痛湯可有效緩解AGA小鼠足爪炎性腫脹程度，下調(diào)炎性因子IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表達(dá)，降低血尿酸濃度。此外，本研究還對(duì)三組小鼠治療前后體質(zhì)量進(jìn)行了組間和組內(nèi)比較，但均未發(fā)現(xiàn)顯著差異，提示造模方法及當(dāng)歸拈痛湯對(duì)小鼠體質(zhì)量無明顯影響，安全、可行。因此，筆者認(rèn)為當(dāng)歸拈痛湯可通過多方面作用（抗炎、調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)、降尿酸）治療AGA，是能夠解決AGA多個(gè)核心問題的有效方劑且安全性較高。

作者貢獻(xiàn)：陳紹華負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)與處理，數(shù)據(jù)分析，論文撰寫與修改；陳紹華、梁倩倩對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；王沁筠、吳昌桂、趙嘯負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材、觀察指標(biāo)測(cè)定、數(shù)據(jù)整理；徐浩負(fù)責(zé)圖像采集；施杞、梁倩倩負(fù)責(zé)研究的設(shè)計(jì)與可行性分析。

本文無利益沖突。